Optogenética ativação de neurônios Zebrafish somatossensoriais usando chef-tdTomato
Summary
Optogenética técnicas tornaram possível estudar a contribuição dos neurónios específicos para o comportamento. Nós descrevemos um método em zebrafish larval para ativar neurônios individuais somatossensoriais expressando uma variante channelrodopsina (chef) com um diodo-bombeado do laser de estado sólido (DPSS) e registrando os comportamentos eliciados com uma câmera de vídeo de alta velocidade.
Abstract
Zebrafish larvais estão a emergir como um modelo para descrever o desenvolvimento ea função de simples circuitos neurais. Devido à sua fertilização externa, o rápido desenvolvimento, e translucidez, peixe-zebra são particularmente bem adequados para as abordagens optogenética para investigar a função do circuito neural. Nesta abordagem, os canais de iões sensíveis à luz são expressos em neurónios específicos, permitindo que o experimentador para activar ou inibir-los à vontade e, assim, avaliar a sua contribuição para comportamentos específicos. A aplicação destes métodos em zebrafish larval é conceitualmente simples, mas exige a otimização de detalhes técnicos. Aqui demonstramos um procedimento para expressar uma variante channelrodopsina nos neurônios de larvas de zebrafish somatossensoriais, foto-ativação de células individuais, e registrando os comportamentos resultantes. Com a introdução de algumas modificações de métodos previamente estabelecidos, esta abordagem pode ser utilizada para eliciar respostas comportamentais de neurónios individuais activados atépara pelo menos 4 dias pós-fertilização (DPF). Especificamente, nós criamos um transgene usando um neurônio somatossensorial enhancer, CREST3, para dirigir a expressão do marcado channelrodopsina variante, chef-tdTomato. Injectar este transgene em células de embriões de uma-etapa resulta na expressão de mosaico em neurónios sensoriais, que podem ser visualizados por microscopia confocal. Illuminating identificaram células desses animais com a luz de um laser de 473 nm DPSS, guiado através de um cabo de fibra óptica, provoca comportamentos que podem ser gravados com uma câmera de vídeo de alta velocidade e analisados quantitativamente. Esta técnica pode ser adaptada para comportamentos de estudo induzidas pela activação de qualquer neurónio de peixe zebra. Combinando esta abordagem com perturbações genéticas ou farmacológicas será uma forma poderosa para investigar a formação de circuito e função.
Introduction
O desenvolvimento de métodos optogenética para promover ou inibir a excitabilidade neuronal com comprimentos de onda de luz definidos, tornou possível estudar a função de populações distintas de neurônios nos circuitos neurais que controlam o comportamento 1, 19, 21. Esta técnica é frequentemente usada para activar grupos de neurónios, mas também pode ser usado para activar os neurónios individuais. Larvas de peixe-zebra são particularmente sensíveis a estes métodos, uma vez que são translúcidos, o sistema nervoso se desenvolve rapidamente, e a criação de animais transgénicos é rápida e de rotina. No entanto, importantes barreiras técnicas devem ser superados para conseguir a ativação confiável único neurônio.
Para otimizar um processo de ativação dos neurônios optogenética zebrafish individuais, nós nos concentramos em neurônios somatossensoriais. Larvas do peixe detectar uma variedade de estímulos somatossensorial, utilizando duas populações de neurônios: os neurônios trigeminais, que inervam a cabeça, e Rohon Barba-(RB), que inervam neurónios do resto do corpo. Cada neurônio trigêmeo e RB projeta um axônio periférico que ramos extensivamente na pele para detectar estímulos e um axônio central que conecta a jusante circuitos neurais. Os animais respondem ao toque tão cedo quanto 21 horas pós-fertilização (hpf), indicando que os circuitos somatossensoriais coerentes formaram 5, 18. Durante o desenvolvimento das larvas, pelo menos, algum do trigémeo e RB sinapse neurônios na célula Mauthner para activar respostas de fuga clássicos, mas a acumular evidência sugere que há múltiplas classes de neurónios somatossensoriais com diferentes padrões de conectividade que podem suscitar variações sobre o comportamento de fuga 2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17. A motivação para o desenvolvimento deste método foi caracterizar a função comportamental de diferentes classes de neurónios sensoriais, mas esta abordagem poderia, em princípio, ser utilizado para estudar a função do neurónio ou quase qualquer população de neurónios no larval zebrafish.
Douglass et ai. Anteriormente descrito um método para a activação channelrodopsina-2-expressando neurônios somatossensoriais com luz azul, provocando o comportamento de escape 3. A sua abordagem utilizado um elemento potenciador do gene ISL1 para conduzir a expressão de CHR2-EYFP em neurónios somatossensorial. Este transgene, no entanto, foi relatado para exibir fluorescência relativamente fraco, o que requer a co-injecção de um segundo repórter, UAS :: GFP, para permitir a visualização das células que expressam CHR2-EYFP. Esta abordagem foi utilizada para obter respostas de comportamento entre 24-48 hpf, mas nunca poderia provocar uma resposta passado 72 hpf. Assim, embora este método funciona para estudar circuitos neurais em muito primeiros estágios larvais (24-48 hpf), é insuficiente para a caracterização de circuitos neurais e respostas comportamentais em larvas mais velhas, quando mais diversas respostas comportamentais são aparentes e os circuitos neurais são mais maduros.
Procuramosmelhorar a sensibilidade desta técnica, a fim de caracterizar a função de sub-populações de neurónios RB larvais. Para melhorar a expressão utilizou-se um intensificador somatossensorial específico (CREST3) 20 para conduzir a expressão de LexA-VP16 e um alongamento de sequências do operador LexA (4xLexAop) 11 para amplificar a expressão de um canal de fluorescência marcado activado pela luz. Esta configuração amplificado expressão do canal, eliminando a necessidade de co-expressão de um segundo repórter e que nos permite determinar directamente a abundância relativa do canal em cada neurónio. Usando a sequência de LexA / LexAOp tinha a vantagem adicional de permitir-nos introduzir o transgene em peixes-zebra linhas repórter que utilizam o sistema Gal4/UAS. A expressão transitória do transgene resultou em níveis variáveis de expressão, mas era geralmente suficientemente robusto para visualizar o corpo da célula e as projecções axonais dos neurônios individuais ao longo de vários dias. Para otimizar a sensibilidadedade de luz que usamos a luz ativado canal chef, uma variante channelrodopsina consistindo de uma quimera de channelopsin-1 (Chop1) e channelopsin-2 (Chop2) com um site de cruzamento na hélice laço EF 13. Este canal é ativado no mesmo comprimento de onda chr2, mas requer menor intensidade de luz para ativação, tornando-a mais sensível do que outros canais comumente usados, incluindo chr2. A proteína chef foi fundida com a proteína fluorescente vermelha, tdTomato, permitindo-nos para a tela para a expressão da proteína sem ativar o canal. Como uma fonte de luz, foi utilizado um diodo bombeado laser de estado sólido (DPSS) acoplado a um cabo de fibra óptica para proporcionar uma precisa, pulso de alta potência de luz azul, para uma região específica da larva. Isto permitiu-nos concentrar a luz laser sobre neurónios individuais, eliminando a necessidade de encontrar raros animais transgénicos que expressam o canal num único neurónio. Usando essa abordagem, fomos capazes de ativar neurônios individuais RB, gravar resposta comportamentals com uma câmera de vídeo de alta velocidade, e os neurônios ativados imagem em alta resolução com microscopia confocal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós descrevemos uma abordagem para optogenética ativação de neurônios individuais em zebrafish RB ao vivo. Nosso método emprega transgenia transitória para expressar uma fluorescente etiquetado variante channelrodopsina, chef-tdTomato 13, em determinados neurônios somatossensoriais. Esta abordagem poderia ser facilmente adaptado para o uso em outras populações de células larvais zebrafish.
Usando essa abordagem, consistentemente induziu respostas comportamentais 34-48 l…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Fumi Kubo, Tod Thiele e HerwigBaier (UCSF / Max Planck Institute) para o conselho em experimentos de comportamento e de laser DPSS estabelecidos; Heesoo Kim e Chiara Cerri do Curso de Neurobiologia MBL para auxiliar na Chef-tdTomato experimentos; PetronellaKettunen (Universidade de Gotemburgo ) para colaboração inicial em experimentos optogenética; BaljitKhakh, Eric Hudson, Mike Baca e John Milligan (UCLA) para assessoria técnica, e Roger Tsien (UCSD) para o chef-tdTomato construir. Este trabalho foi financiado por uma concessão NRSA (5F31NS064817) para AMSP e uma bolsa da NSF (RIG: 0819010) para AS.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 1367820B | or equivalent (10-15 mm diameter) |
| 200 μm optic fiber | ThorLabs | AFS200/220Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| 50 μm optic fiber | ThorLabs | AFS50/125Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| Adjustable Stripping Tool | ThorLabs | AFS900 | or Three-Hole Stripping Tool (FTS4) |
| Diamond Wedge scribe | ThorLabs | S90W | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | or equivalent |
| Borosilicate glass tubing with filament | Sutter Instruments | BF-100-78-10 | |
| Injection mold | n/a | n/a | Figure 5 |
| 1.5 ml centrifuge tubes | Any | Any | |
| Petri dish (100×15 mm) | Any | Any | |
| Petri dish (60×15 mm) | Any | Any | |
| Pressure injector | ASI | MPPI-3 | or equivalent |
| Micromanipulator and metal stand | Narashige | M152 | or equivalent |
| Disposable plastic pipettes | Fisherbrand | 13-711-7 | or equivalent |
| Poker (Pin holder and Insect pin) | Fine Science Tools, Inc. | 26018-17 and 26000-70 | or equivalent |
| Forceps | Fine Science Tools, Inc. | 11255-20 | or equivalent |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 9300001007 | |
| 28.5 °C incubator | any | any | |
| 42 °C heat block | Any | Any | |
| Non-Sterile scalpel blades #11 | Fine Scientific Tools, Inc. | 10011-00 | or equivalent |
| Dissecting scope | Zeiss | Stemi | or equivalent |
| Fluorescent dissecting scope with standard filter | Any | any | or equivalent |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 or 710 | or equivalent with lasers for GFP and RFP, and 10x, 20x and 40x objectives |
| High speed camera | AOS Technologies, Inc. | X-PRI (130025-10) | or equivalent |
| 473 nm portable laser | Crystal lasers | CL-473-050 | or higher power, with TTL option |
| S48 Stimulator | Astro-Med, Inc. Grass Instrument division | S48K | or equivalent |
| FC/PC to FC/PC mating sleeve | ThorLabs | ADAFC1 | May need for optic cable connection |
| Laser Safety Glasses | ThorLabs | LG10 | or equivalent |
| 24 culture plates | Genesee | 25-102 | or equivalent |
| Single depression slides | Fisher | S175201 | Or equivalent |
| Reagent | |||
| Instant ocean | Aquatic Ecosystems | IS50 | |
| Methylene blue | Fisher | S71325 | |
| Phenol red | Sigma | P4758 | |
| Agarose | EMD | 2125 | or equivalent |
| Low Melt agarose | Sigma | A9045 | or equivalent |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Tricaine | Sigma | A5040 | |
| blue/embryo water | 10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue |
||
| phenol red | (5 mg/ml in 0.2 M KCl) | ||
| 100x PTU | 0.150 g PTU 50 ml ddH2O dissolve at 70 °C, shake often aliquot and store at -20 °C |
||
| 1x PTU | 1 ml 100x PTU 99 ml blue/fish water |
||
| Tricaine stock solution | 400 mg tricaine 97.9 ddH2O |
||
| ~2.1 ml 1M Tris, pH9.0 | adjust pH to ~7.0 store in 4 °C or -20 °C for long term storage |
References
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