تحديد الخلايا العصبية الحركية خارج الخلية لعضلة حمام سباحة للسيارات في<em> Aplysia californica</em
Summary
في الحيوانات الكبيرة مع الخلايا العصبية التي تم تحديدها (<em> على سبيل المثال</em> الرخويات)، ويتم تحليل حمامات السيارات باستخدام تقنيات الخلايا<sup> 1،2،3،4</sup>. مؤخرا، قمنا بتطوير تقنية لتحفيز الخلايا العصبية خارج الخلية وتسجيل الأفراد في<em> Aplysia californica</em<sup> 5</sup>. وصفنا الآن على بروتوكول لاستخدام هذه التقنية لتحديد وتوصيف فريد الخلايا العصبية الحركية داخل حوض المحرك.
Abstract
في الحيوانات الكبيرة مع الخلايا العصبية التي تم تحديدها (مثل الرخويات)، وتحليل حمامات السيارات ويتم باستخدام تقنيات الخلايا 1،2،3،4. مؤخرا، قمنا بتطوير تقنية لتحفيز الخلايا العصبية خارج الخلية وتسجيل الأفراد في californica Aplysia 5. وصفنا الآن على بروتوكول لاستخدام هذه التقنية لتحديد وتوصيف فريد الخلايا العصبية الحركية داخل حوض المحرك.
هذه التقنية خارج الخلية من المزايا. أولا، يمكن تحفيز كهربائي خارج الخلية والخلايا العصبية من خلال تسجيل غمد 5، لذلك لا بد من إزالتها. وهكذا، سوف تكون أكثر صحة الخلايا العصبية في التجارب خارج الخلية مما كان عليه في تلك الخلايا. ثانيا، إذا العقد يتم تناوب المناسبة من قبل تعلق من غمد، يمكن الوصول إلى الخلايا العصبية خارج الخلية أقطاب على جانبي العقدة، مما يجعل من أسهل وأكثر كفاءة لتحديد الخلايا العصبية متعددة في إعداد نفسه. الثالث، extracelluلار الأقطاب لا تحتاج إلى اختراق الخلايا، وبالتالي يمكن نقلها بسهولة ذهابا وإيابا بين الخلايا العصبية، مما تسبب في أضرار أقل لهم. هذا هو مفيدة بشكل خاص عند واحد يحاول تسجيل متعددة الخلايا العصبية خلال تكرار أنماط الحركية التي قد تستمر لدقائق فقط. الرابعة، أقطاب خارج الخلية هي أكثر مرونة من تلك الخلايا خلال حركات العضلات. قد الأقطاب الكهربائية بين الخلايا وتلف سحب الخلايا العصبية خلال تقلصات العضلات. في المقابل، يتم الضغط بلطف منذ الأقطاب خارج الخلية إلى الخلايا العصبية وغمد أعلاه، فإنها عادة البقاء فوق الخلايا العصبية ذاتها خلال تقلصات العضلات، وبالتالي يمكن استخدامها في الأعمال التحضيرية أكثر سليمة.
لتحديد الخلايا العصبية الحركية بشكل فريد لمجموعة السيارات (وخاصة العضلات I1/I3 في Aplysia) باستخدام أقطاب خارج الخلية، يمكن للمرء استخدام الميزات التي لا تتطلب قياسات داخل الخلايا كمعايير: سوما الحجم والموقع، الإسقاط محور عصبي، وتعصيب العضلات 4، 6،7. لتجمع السيارات المستعملة خاصة لتوضيح هذه التقنية، سجلنا من الأعصاب الشدق 2 و 3 لقياس التوقعات محور عصبي، وقياس قوات تقلص العضلات I1/I3 لتحديد نمط تعصيب العضلات لالخلايا العصبية الحركية الفردية.
علينا أن نبرهن العملية الكاملة لأول الخلايا العصبية الحركية باستخدام تحديد تعصيب العضلات، ثم تميز توقيتها خلال أنماط السيارات، وخلق طريقة مبسطة لتحديد التشخيص السريع. طريقة مبسطة وسريعة أكثر التشخيص متفوقة للتحضير أكثر سليمة، على سبيل المثال في إعداد الشامل الشدق علقت 8 أو في الجسم الحي 9. ويمكن أيضا أن تطبق هذه العملية في أحواض السيارات الأخرى في 10،11،12 Aplysia أو في النظم الحيوانية الأخرى 2،3،13،14.
Protocol
Representative Results
Discussion
في الحيوانات الكبيرة مع الخلايا العصبية التي تم تحديدها، مثل الرخويات (على سبيل المثال، المنقعية، اللولب، وAplysia)، وتحليل حمامات السيارات يتم عادة باستخدام الخلايا تسجيل 1،2،3،4. في هذا البروتوكول، ونحن تصف عملية لتحديد الخلايا العصبية الحركية بشكل فريد لم?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح NS047073 وNSF DMS1010434 المنحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671 | Biological, Certified |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 | Certified ACS |
| Magnesium chloride hexahydrate | Acros Organics | 19753 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63 | Certified ACS |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientifc | C79 | Certified ACS |
| Glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | BioXtra |
| MOPS buffer | Acros Organics | 17263 | 99% |
| Carbachol | Acros Organics | 10824 | 99% |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS255 | Certified |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Certified |
| Single-barreled capillary glass | A-M Systems | 6150 | |
| Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC | Sutter Instruments | Filament used: FT345B | |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE | ||
| Duro Quick-Gel superglue | Henkel corp. | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings: 10-500 Hz for the I2 nerve/muscle; 300-500 Hz for all the other nerves | |
| Pulsemaster Multi-Channel Stimulator | World Precision Instruments | A300 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| AxoGraph X | AxoGraph Scientific | Software for recordings | |
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow Corning | ||
| 100 x 15 mm Crystalizing Dish | Pyrex | ||
| High Vacuum Grease | Dow Corning | ||
| Pipet Tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4400 | |
| Whisper Air Pump | Tetra | 77849 | |
| Aquarium Tubing | Eheim | 7783 | 12/16 mm |
| Elite Airstone | Hagen | A962 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 |
References
- McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
- Benjamin, P. R., Rose, R. M. Central generation of bursting in the feeding system of the snail, Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 80, 93-118 (1979).
- Peters, M., Altrup, U. Motor organization in pharynx of Helix pomatia. J. Neurophysiol. 52 (3), 389-409 (1984).
- Church, P. J., Cohen, K. P., Scott, M. L., Kirk, M. D. Peptidergic motoneurons in the buccal ganglia of Aplysia californica: immunocytochemical, morphological, and physiological characterizations. J. Comp. Physiol. A. 168 (3), 323-336 (1991).
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural. Eng. 5 (3), 287-309 (2008).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia. J. Neurosci. 11 (3), 618-625 (1991).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia. J. Neurophys. 72 (4), 1794-1809 (1994).
- McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (70), e4320 (2012).
- Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals. J Vis. Exp. (40), e1791 (2010).
- Zhurov, Y., Weiss, K. R., Brezina, V. Tight or loose coupling between components of the feeding neuromusculature of Aplysia. J. Neurophysiol. 94 (1), 531-549 (2005).
- Hurwitz, I., Goldstein, R. S., Susswein, A. J. Compartmentalization of pattern-initiation and motor functions in the B31 and B32 neurons of the buccal ganglia of Aplysia californica. J. Neurophysiol. 71 (4), 1514-1527 (1994).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 173 (5), 519-536 (1993).
- Iles, J. F. Structure and synaptic activation of the fast coxal depressor motoneurone of the cockroach. Periplaneta americana. J. Exp. Biol. 56 (3), 647-656 (1972).
- Westerfield, M., McMurray, J. V., Eisen, J. S. Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish. J. Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).
- Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica. J. Comp. Physiol. A. 179 (4), 509-524 (1996).
- Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. J. Neurophys. 75 (4), 1309-1326 (1996).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 172 (1), 17-32 (1993).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single-unit extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57 (2), 161-169 (1995).
- Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning. J. Neurosci. 17 (21), 8093-8105 (1997).
- Kandel, E. R. . Behavioral biology of Aplysia. , (1979).
- Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica. J. Comp. Neurol. 312 (2), 207-222 (1991).
- Rosen, S. C., Miller, M. W., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Outputs of radula mechanoafferent neurons in Aplysia are modulated by motor neurons, interneurons, and sensory neurons. J. Neurophysiol. 83 (3), 1621-1636 (2000).
- Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia. J. Neurophysiol. 83 (3), 1605-1620 (2000).
- Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia. J. Neurosci. 6 (8), 2403-2415 (1986).
- Rosen, S. C., Teyke, T., Miller, M. W., Weiss, K. R., Kupfermann, I. Identification and characterization of cerebral-to-buccal interneurons implicated in the control of motor programs associated with feeding in Aplysia. J. Neurosci. 11 (11), 3630-3655 (1991).
- Jing, J., Weiss, K. R. Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network. Curr. Biol. 15 (19), 1712-1721 (2005).
- Azizi, F., Lu, H., Chiel, H. J., Mastrangelo, C. H. Chemical neurostimulation using pulse code modulation (PCM) microfluidic chips. J. Neurosci. Methods. 192 (2), 193-198 (2010).
- Zhurov, Y., Proekt, A., Weiss, K. R., Brezina, V. Changes of internal state are expressed in coherent shifts of neuromuscular activity in Aplysia feeding behavior. J. Neurosci. 25 (5), 1268-1280 (2005).
- Baker, B. J., Kosmidis, E. K., Vucinic, D., Falk, C. X., Cohen, L. B., Djurisic, M., Zecevic, D. Imaging brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Cell. Mol. Neurobiol. 25 (2), 245-282 (2005).
- Fejtl, M., Stett, A., Nisch, W., Boven, K. -. H., Möller, A., Baudry, M., Taketani, M. On Micro-Electrode Array Revival. Advances in Network Electrophysiology Using Multi-Electrode Arrays. , 24-37 (2006).
