Hos dyr med store identificerede neuroner (<em> F.eks</em> Bløddyr), er analysen af motoriske puljer gøres ved hjælp intracellulære teknikker<sup> 1,2,3,4</sup>. For nylig har vi udviklet en teknik til ekstracellulært stimulere og registrere individuelle neuroner i<em> Aplysia californica</em<sup> 5</sup>. Vi beskriver nu en protokol til at bruge denne teknik til entydigt at identificere og karakterisere motorneuroner i en motor pool.
Hos dyr med store identificeret neuroner (f.eks bløddyr), analyse af motordrevne puljer sker ved hjælp af intracellulære teknikker 1,2,3,4. For nylig har vi udviklet en teknik til ekstracellulært stimulere og registrere individuelle neuroner i Aplysia californica 5. Vi beskriver nu en protokol til at bruge denne teknik til entydigt at identificere og karakterisere motorneuroner i en motor pool.
Denne ekstracellulære teknik har fordele. Det første ekstracellulære elektroder kan stimulere og optage neuroner gennem kappen 5, så det ikke er nødvendigt at fjerne. Således vil neuroner være sundere i ekstracellulære forsøg end i intracellulære dem. For det andet, hvis ganglier roteres af passende pinning af hylsteret, kan ekstracellulære elektroder adgang neuroner på begge sider af ganglion, hvilket gør det nemmere og mere effektivt at identificere flere neuroner i det samme præparat. For det tredje extracellunende elektroderne behøver ikke at trænge celler, og således let kan bevæges frem og tilbage mellem neuroner, der forårsager mindre skade på dem. Dette er især nyttigt, når man forsøger at optage flere neuroner under gentage motoriske mønstre, der kan kun overleve i få minutter. Fjerde ekstracellulære elektroder er mere fleksible end intracellulære dem under muskelbevægelser. Intracellulære elektroder kan trække sig ud og beskadige neuroner under muskelsammentrækninger. I modsætning hertil, da ekstracellulære elektroder forsigtigt presses på hylsteret ovenfor neuroner de normalt ligge over det samme neuron under muskelsammentrækninger, og således kan bruges i mere intakte præparater.
Til entydigt at identificere motoriske neuroner for en motor pool (især I1/I3 muskel i Aplysia) ved hjælp af ekstracellulære elektroder, kan man bruge funktioner, der ikke kræver intracellulære målinger som kriterier: soma størrelse og placering, axonal projektion, og muskel innervation 4, 6,7. For den bestemte motor pool benyttet til at illustrere teknikken, registrerede vi fra buccale nerver 2 og 3 for at måle axonale projektioner, og målte sammentrækning kræfter I1/I3 musklen at bestemme mønsteret for musklen innervation til de enkelte motorneuroner.
Vi viser hele processen med først at identificere motoriske neuroner ved hjælp af muskel innervation, så karakteriserer deres timing i løbet af motoriske mønstre, der skaber en forenklet diagnostisk metode til hurtig identifikation. Den forenklede og hurtigere diagnostisk metode er bedre til mere intakte præparater, fx i den suspenderede bukkale masse forberedelse 8 eller in vivo 9. Denne proces kan også anvendes i andre motoriske pools 10,11,12 i Aplysia eller i andre dyresystemer 2,3,13,14.
Hos dyr med store identificerede neuroner, såsom bløddyr (f.eks Lymnaea, Helix og Aplysia), analyse af motordrevne pools sker typisk ved hjælp af intracellulær optagelse 1,2,3,4. I denne protokol, beskriver vi en proces til entydigt at identificere de motoriske neuroner for en motor pool med en ekstracellulær teknik. Vi brugte kraftmålinger som en illustration af denne proces. Man kunne også bruge EMG til at måle muskel innervationer. Kort fortalt at gøre det, protokollen skal ændr…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af NIH tilskud NS047073 og NSF tilskud DMS1010434.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sodium chloride | Fisher Scientific | S671 | Biological, Certified |
Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 | Certified ACS |
Magnesium chloride hexahydrate | Acros Organics | 19753 | 99% |
Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63 | Certified ACS |
Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientifc | C79 | Certified ACS |
Glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | BioXtra |
MOPS buffer | Acros Organics | 17263 | 99% |
Carbachol | Acros Organics | 10824 | 99% |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS255 | Certified |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Certified |
Single-barreled capillary glass | A-M Systems | 6150 | |
Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC | Sutter Instruments | Filament used: FT345B | |
Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire | 0.001D, coating h | |
Household Silicone II Glue | GE | ||
Duro Quick-Gel superglue | Henkel corp. | ||
A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings: 10-500 Hz for the I2 nerve/muscle; 300-500 Hz for all the other nerves | |
Pulsemaster Multi-Channel Stimulator | World Precision Instruments | A300 | |
Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
AxoGraph X | AxoGraph Scientific | Software for recordings | |
Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 | |
Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow Corning | ||
100 x 15 mm Crystalizing Dish | Pyrex | ||
High Vacuum Grease | Dow Corning | ||
Pipet Tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
Modeling Clay | Sargent Art | 22-4400 | |
Whisper Air Pump | Tetra | 77849 | |
Aquarium Tubing | Eheim | 7783 | 12/16 mm |
Elite Airstone | Hagen | A962 | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 |