Identifier les motoneurones extracellulaire d'un Motor Pool musculaire dans<em> Aplysia californica</em
Summary
Chez les animaux avec de grands neurones identifiés (<em> Par exemple,</em> Mollusques), l'analyse des piscines moteur est fait en utilisant des techniques intracellulaires<sup> 1,2,3,4</sup>. Récemment, nous avons développé une technique pour stimuler et enregistrer extracellulaire des neurones individuels dans<em> Aplysia californica</em<sup> 5</sup>. Nous allons maintenant décrire un protocole d'utilisation de cette technique pour identifier et caractériser les neurones moteurs au sein d'un parc de véhicules.
Abstract
Chez les animaux avec de grands neurones identifiés (par exemple les mollusques), l'analyse des piscines moteur est fait en utilisant des techniques intracellulaires 1,2,3,4. Récemment, nous avons développé une technique pour stimuler et enregistrer extracellulaire des neurones individuels dans Aplysia californica 5. Nous allons maintenant décrire un protocole d'utilisation de cette technique pour identifier et caractériser les neurones moteurs au sein d'un parc de véhicules.
Cette technique présente des avantages extra-cellulaire. Premièrement, les électrodes extracellulaires peuvent stimuler et enregistrer les neurones à travers la gaine 5, de sorte qu'il n'a pas besoin d'être enlevé. Ainsi, les neurones seront en meilleure santé dans les expériences extra-que dans les intracellulaires. Deuxièmement, si les ganglions sont tournées appropriée la fixation de la gaine, électrodes extracellulaires peuvent accéder à des neurones des deux côtés du ganglion, ce qui rend plus facile et plus efficace d'identifier les neurones multiples dans la même préparation. Troisièmement, extracellulairelar électrodes n'ont pas besoin de pénétrer dans les cellules, et peuvent donc être facilement déplacé d'avant en arrière entre les neurones, ce qui provoque moins de dégâts à eux. Ceci est particulièrement utile quand on essaie d'enregistrer plusieurs neurones au cours de la répétition des schémas moteurs qui ne peuvent persister pendant quelques minutes. Quatrièmement, les électrodes extracellulaires sont plus souples que celles intracellulaires lors des mouvements musculaires. Électrodes intracellulaires peuvent sortir et endommager les neurones pendant les contractions musculaires. En revanche, depuis électrodes extracellulaires sont légèrement pressés sur la gaine au-dessus de neurones, ils restent habituellement au-dessus du même neurone pendant les contractions musculaires, et peut donc être utilisé dans plusieurs préparations intactes.
Pour identifier les neurones moteurs pour un parc de véhicules (en particulier, le muscle chez l'aplysie I1/I3) en utilisant des électrodes extracellulaires, on peut utiliser des fonctionnalités qui ne nécessitent pas de mesures intracellulaires comme critères: la taille et l'emplacement soma, la projection axonale et l'innervation muscle 4, 6,7. Pour le parc de véhicules particulier utilisé pour illustrer la technique, nous avons enregistré des nerfs buccaux 2 et 3 pour mesurer projections axonales, et mesuré les forces de contraction du muscle I1/I3 pour déterminer le modèle de l'innervation musculaire pour les neurones moteurs individuels.
Nous démontrons le processus complet des premiers neurones moteurs identifier en utilisant l'innervation musculaire, puis la caractérisation de leur temps au cours de la motricité, la création d'une méthode simplifiée de diagnostic pour l'identification rapide. Le procédé plus simple et plus rapide de diagnostic est supérieure à la préparation plus intactes, par exemple dans la préparation de masse buccale suspendu 8 ou 9 in vivo. Ce procédé peut aussi être appliqué dans les piscines à moteur autres 10,11,12 chez l'aplysie ou dans des systèmes animaux autres 2,3,13,14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Chez les animaux avec de grands neurones identifiés, tels que les mollusques (par exemple, Lymnaea, Helix, et Aplysia), l'analyse des piscines moteur est généralement fait en utilisant un enregistrement intracellulaire 1,2,3,4. Dans ce protocole, nous décrivons un processus pour identifier de manière unique les neurones moteurs pour un parc automobile en utilisant une technique extracellulaire. Nous avons utilisé les mesures de force comme une illustration de ce processus. On pourr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par le NIH et la NSF subvention NS047073 subvention DMS1010434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671 | Biological, Certified |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 | Certified ACS |
| Magnesium chloride hexahydrate | Acros Organics | 19753 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63 | Certified ACS |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientifc | C79 | Certified ACS |
| Glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | BioXtra |
| MOPS buffer | Acros Organics | 17263 | 99% |
| Carbachol | Acros Organics | 10824 | 99% |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS255 | Certified |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Certified |
| Single-barreled capillary glass | A-M Systems | 6150 | |
| Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC | Sutter Instruments | Filament used: FT345B | |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE | ||
| Duro Quick-Gel superglue | Henkel corp. | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings: 10-500 Hz for the I2 nerve/muscle; 300-500 Hz for all the other nerves | |
| Pulsemaster Multi-Channel Stimulator | World Precision Instruments | A300 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| AxoGraph X | AxoGraph Scientific | Software for recordings | |
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow Corning | ||
| 100 x 15 mm Crystalizing Dish | Pyrex | ||
| High Vacuum Grease | Dow Corning | ||
| Pipet Tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4400 | |
| Whisper Air Pump | Tetra | 77849 | |
| Aquarium Tubing | Eheim | 7783 | 12/16 mm |
| Elite Airstone | Hagen | A962 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 |
References
- McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
- Benjamin, P. R., Rose, R. M. Central generation of bursting in the feeding system of the snail, Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 80, 93-118 (1979).
- Peters, M., Altrup, U. Motor organization in pharynx of Helix pomatia. J. Neurophysiol. 52 (3), 389-409 (1984).
- Church, P. J., Cohen, K. P., Scott, M. L., Kirk, M. D. Peptidergic motoneurons in the buccal ganglia of Aplysia californica: immunocytochemical, morphological, and physiological characterizations. J. Comp. Physiol. A. 168 (3), 323-336 (1991).
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural. Eng. 5 (3), 287-309 (2008).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia. J. Neurosci. 11 (3), 618-625 (1991).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia. J. Neurophys. 72 (4), 1794-1809 (1994).
- McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (70), e4320 (2012).
- Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals. J Vis. Exp. (40), e1791 (2010).
- Zhurov, Y., Weiss, K. R., Brezina, V. Tight or loose coupling between components of the feeding neuromusculature of Aplysia. J. Neurophysiol. 94 (1), 531-549 (2005).
- Hurwitz, I., Goldstein, R. S., Susswein, A. J. Compartmentalization of pattern-initiation and motor functions in the B31 and B32 neurons of the buccal ganglia of Aplysia californica. J. Neurophysiol. 71 (4), 1514-1527 (1994).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 173 (5), 519-536 (1993).
- Iles, J. F. Structure and synaptic activation of the fast coxal depressor motoneurone of the cockroach. Periplaneta americana. J. Exp. Biol. 56 (3), 647-656 (1972).
- Westerfield, M., McMurray, J. V., Eisen, J. S. Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish. J. Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).
- Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica. J. Comp. Physiol. A. 179 (4), 509-524 (1996).
- Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. J. Neurophys. 75 (4), 1309-1326 (1996).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 172 (1), 17-32 (1993).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single-unit extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57 (2), 161-169 (1995).
- Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning. J. Neurosci. 17 (21), 8093-8105 (1997).
- Kandel, E. R. . Behavioral biology of Aplysia. , (1979).
- Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica. J. Comp. Neurol. 312 (2), 207-222 (1991).
- Rosen, S. C., Miller, M. W., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Outputs of radula mechanoafferent neurons in Aplysia are modulated by motor neurons, interneurons, and sensory neurons. J. Neurophysiol. 83 (3), 1621-1636 (2000).
- Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia. J. Neurophysiol. 83 (3), 1605-1620 (2000).
- Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia. J. Neurosci. 6 (8), 2403-2415 (1986).
- Rosen, S. C., Teyke, T., Miller, M. W., Weiss, K. R., Kupfermann, I. Identification and characterization of cerebral-to-buccal interneurons implicated in the control of motor programs associated with feeding in Aplysia. J. Neurosci. 11 (11), 3630-3655 (1991).
- Jing, J., Weiss, K. R. Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network. Curr. Biol. 15 (19), 1712-1721 (2005).
- Azizi, F., Lu, H., Chiel, H. J., Mastrangelo, C. H. Chemical neurostimulation using pulse code modulation (PCM) microfluidic chips. J. Neurosci. Methods. 192 (2), 193-198 (2010).
- Zhurov, Y., Proekt, A., Weiss, K. R., Brezina, V. Changes of internal state are expressed in coherent shifts of neuromuscular activity in Aplysia feeding behavior. J. Neurosci. 25 (5), 1268-1280 (2005).
- Baker, B. J., Kosmidis, E. K., Vucinic, D., Falk, C. X., Cohen, L. B., Djurisic, M., Zecevic, D. Imaging brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Cell. Mol. Neurobiol. 25 (2), 245-282 (2005).
- Fejtl, M., Stett, A., Nisch, W., Boven, K. -. H., Möller, A., Baudry, M., Taketani, M. On Micro-Electrode Array Revival. Advances in Network Electrophysiology Using Multi-Electrode Arrays. , 24-37 (2006).
