Extrazellulär identifizieren Motor Neurons für einen Muscle Motor Pool in<em> Aplysia californica</em
Summary
Bei Tieren mit großen identifizierten Neuronen (<em> ZB</em> Weichtiere), wird die Analyse des Fuhrparks erfolgt über intrazelluläre Techniken<sup> 1,2,3,4</sup>. Vor kurzem haben wir eine Technik, um extrazellulär stimulieren und aufzeichnen einzelnen Neuronen in<em> Aplysia californica</em<sup> 5</sup>. Wir beschreiben nun ein Protokoll für die Verwendung dieser Technik zur eindeutigen Identifizierung und Charakterisierung Motoneuronen in einem Fuhrpark.
Abstract
Bei Tieren mit großen identifizierten Neuronen (zB Weichtiere), Analyse von Fuhrparks erfolgt über intrazelluläre Techniken 1,2,3,4. Vor kurzem haben wir eine Technik, um extrazellulär stimulieren und aufzeichnen einzelnen Neuronen in Aplysia californica 5. Wir beschreiben nun ein Protokoll für die Verwendung dieser Technik zur eindeutigen Identifizierung und Charakterisierung Motoneuronen in einem Fuhrpark.
Diese Technik hat extrazellulären Vorteile. Erstens extrazellulären Elektroden stimulieren kann und aufzuzeichnen Neuronen durch die Hülle 5, so dass es nicht entfernt werden müssen. So wird Neuronen gesünder in der extrazellulären Experimenten als im intrazellulären diejenigen. Zweitens, wenn Ganglien gedreht werden durch geeignete Pinning der Hülle können extrazelluläre Elektroden zuzugreifen Neuronen auf beiden Seiten des Ganglion, das es einfacher und effizienter zu mehreren Neuronen in der gleichen Präparation zu identifizieren. Drittens extrazellulärenlar Elektroden brauchen nicht in Zellen eindringen, und somit leicht hin und her bewegt werden zwischen Neuronen, was zu weniger Schäden an ihnen. Dies ist besonders nützlich, wenn man mehrere Neuronen während wiederholenden Bewegungsmuster, die nur für Minuten andauern kann aufzuzeichnen versucht. Viertens extrazellulären Elektroden sind flexibler als intrazelluläre Wieder während Muskelbewegungen. Intrazelluläre Elektroden können herausziehen und beschädigen Neuronen während Muskelkontraktionen. Da im Gegensatz dazu extrazellulären Elektroden sanft auf der Hülle oberhalb Neuronen gedrückt werden, sie in der Regel oberhalb derselben Neuron bleiben während Muskelkontraktionen, und können daher in mehreren intakten Zubereitungen verwendet werden.
Zur eindeutigen Identifizierung Motoneuronen für einen Motor Pool (insbesondere die I1/I3 Muskel in Aplysia) mit extrazellulären Elektroden, kann man Funktionen, die keine intrazelluläre Messungen Kriterien: soma Größe und Lage, axonale Projektion und Muskelinnervation 4, 6,7. Für den bestimmten Motor Pool verwendet, um die Technik zu veranschaulichen, wiesen wir von bukkal Nerven 2 und 3, die Axon-Vorsprünge zu messen, und die gemessene Kontraktionskräfte des I1/I3 Muskel um das Muster der Muskelinnervation für die einzelnen Motoneuronen zu bestimmen.
Wir zeigen den kompletten Prozess der ersten Identifizierung von Motoneuronen mit Muskelinnervation, dann Charakterisierung ihrer Zeit während Bewegungsmuster, die Schaffung eines vereinfachten diagnostisches Verfahren zur schnellen Identifizierung. Die vereinfachte und schnelle diagnostische Verfahren überlegen ist für mehr intakt Zubereitungen, z. B. in der suspendierten bukkalen Masseaufbereitung 8 oder 9 in vivo. Dieses Verfahren kann auch in anderen Motor-Pools aufgebracht werden, 10,11,12 Aplysia oder in anderen tierischen Systemen 2,3,13,14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bei Tieren mit großen identifizierten Neuronen, wie Weichtiere (z. B. Lymnaea, Helix und Aplysia), Analyse von Fuhrparks erfolgt typischerweise mittels intrazellulärer Aufnahme 1,2,3,4. In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren zum eindeutigen Identifizieren der Motoneuronen für einen Fuhrpark mit einer extrazellulären Technik. Wir verwendeten die Kraftmessungen als Illustration dieses Prozesses. Man könnte auch EMG, um Muskeln Innervationen messen. Kurz gesagt, dies zu tun, mus…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von NIH NS047073 und NSF DMS1010434 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671 | Biological, Certified |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 | Certified ACS |
| Magnesium chloride hexahydrate | Acros Organics | 19753 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63 | Certified ACS |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientifc | C79 | Certified ACS |
| Glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | BioXtra |
| MOPS buffer | Acros Organics | 17263 | 99% |
| Carbachol | Acros Organics | 10824 | 99% |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS255 | Certified |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Certified |
| Single-barreled capillary glass | A-M Systems | 6150 | |
| Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC | Sutter Instruments | Filament used: FT345B | |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE | ||
| Duro Quick-Gel superglue | Henkel corp. | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings: 10-500 Hz for the I2 nerve/muscle; 300-500 Hz for all the other nerves | |
| Pulsemaster Multi-Channel Stimulator | World Precision Instruments | A300 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| AxoGraph X | AxoGraph Scientific | Software for recordings | |
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow Corning | ||
| 100 x 15 mm Crystalizing Dish | Pyrex | ||
| High Vacuum Grease | Dow Corning | ||
| Pipet Tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4400 | |
| Whisper Air Pump | Tetra | 77849 | |
| Aquarium Tubing | Eheim | 7783 | 12/16 mm |
| Elite Airstone | Hagen | A962 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 |
References
- McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
- Benjamin, P. R., Rose, R. M. Central generation of bursting in the feeding system of the snail, Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 80, 93-118 (1979).
- Peters, M., Altrup, U. Motor organization in pharynx of Helix pomatia. J. Neurophysiol. 52 (3), 389-409 (1984).
- Church, P. J., Cohen, K. P., Scott, M. L., Kirk, M. D. Peptidergic motoneurons in the buccal ganglia of Aplysia californica: immunocytochemical, morphological, and physiological characterizations. J. Comp. Physiol. A. 168 (3), 323-336 (1991).
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural. Eng. 5 (3), 287-309 (2008).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia. J. Neurosci. 11 (3), 618-625 (1991).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia. J. Neurophys. 72 (4), 1794-1809 (1994).
- McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (70), e4320 (2012).
- Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals. J Vis. Exp. (40), e1791 (2010).
- Zhurov, Y., Weiss, K. R., Brezina, V. Tight or loose coupling between components of the feeding neuromusculature of Aplysia. J. Neurophysiol. 94 (1), 531-549 (2005).
- Hurwitz, I., Goldstein, R. S., Susswein, A. J. Compartmentalization of pattern-initiation and motor functions in the B31 and B32 neurons of the buccal ganglia of Aplysia californica. J. Neurophysiol. 71 (4), 1514-1527 (1994).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 173 (5), 519-536 (1993).
- Iles, J. F. Structure and synaptic activation of the fast coxal depressor motoneurone of the cockroach. Periplaneta americana. J. Exp. Biol. 56 (3), 647-656 (1972).
- Westerfield, M., McMurray, J. V., Eisen, J. S. Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish. J. Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).
- Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica. J. Comp. Physiol. A. 179 (4), 509-524 (1996).
- Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. J. Neurophys. 75 (4), 1309-1326 (1996).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 172 (1), 17-32 (1993).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single-unit extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57 (2), 161-169 (1995).
- Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning. J. Neurosci. 17 (21), 8093-8105 (1997).
- Kandel, E. R. . Behavioral biology of Aplysia. , (1979).
- Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica. J. Comp. Neurol. 312 (2), 207-222 (1991).
- Rosen, S. C., Miller, M. W., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Outputs of radula mechanoafferent neurons in Aplysia are modulated by motor neurons, interneurons, and sensory neurons. J. Neurophysiol. 83 (3), 1621-1636 (2000).
- Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia. J. Neurophysiol. 83 (3), 1605-1620 (2000).
- Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia. J. Neurosci. 6 (8), 2403-2415 (1986).
- Rosen, S. C., Teyke, T., Miller, M. W., Weiss, K. R., Kupfermann, I. Identification and characterization of cerebral-to-buccal interneurons implicated in the control of motor programs associated with feeding in Aplysia. J. Neurosci. 11 (11), 3630-3655 (1991).
- Jing, J., Weiss, K. R. Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network. Curr. Biol. 15 (19), 1712-1721 (2005).
- Azizi, F., Lu, H., Chiel, H. J., Mastrangelo, C. H. Chemical neurostimulation using pulse code modulation (PCM) microfluidic chips. J. Neurosci. Methods. 192 (2), 193-198 (2010).
- Zhurov, Y., Proekt, A., Weiss, K. R., Brezina, V. Changes of internal state are expressed in coherent shifts of neuromuscular activity in Aplysia feeding behavior. J. Neurosci. 25 (5), 1268-1280 (2005).
- Baker, B. J., Kosmidis, E. K., Vucinic, D., Falk, C. X., Cohen, L. B., Djurisic, M., Zecevic, D. Imaging brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Cell. Mol. Neurobiol. 25 (2), 245-282 (2005).
- Fejtl, M., Stett, A., Nisch, W., Boven, K. -. H., Möller, A., Baudry, M., Taketani, M. On Micro-Electrode Array Revival. Advances in Network Electrophysiology Using Multi-Electrode Arrays. , 24-37 (2006).
