Identifier les motoneurones extracellulaire d'un Motor Pool musculaire dans Aplysia californica

Summary

Chez les animaux avec de grands neurones identifiés ( Par exemple, Mollusques), l'analyse des piscines moteur est fait en utilisant des techniques intracellulaires ^1,2,3,4. Récemment, nous avons développé une technique pour stimuler et enregistrer extracellulaire des neurones individuels dans Aplysia californica 5. Nous allons maintenant décrire un protocole d'utilisation de cette technique pour identifier et caractériser les neurones moteurs au sein d'un parc de véhicules.

Abstract

Chez les animaux avec de grands neurones identifiés (par exemple les mollusques), l'analyse des piscines moteur est fait en utilisant des techniques intracellulaires ^1,2,3,4. Récemment, nous avons développé une technique pour stimuler et enregistrer extracellulaire des neurones individuels dans Aplysia californica ^5. Nous allons maintenant décrire un protocole d'utilisation de cette technique pour identifier et caractériser les neurones moteurs au sein d'un parc de véhicules.

Cette technique présente des avantages extra-cellulaire. Premièrement, les électrodes extracellulaires peuvent stimuler et enregistrer les neurones à travers la gaine ^5, de sorte qu'il n'a pas besoin d'être enlevé. Ainsi, les neurones seront en meilleure santé dans les expériences extra-que dans les intracellulaires. Deuxièmement, si les ganglions sont tournées appropriée la fixation de la gaine, électrodes extracellulaires peuvent accéder à des neurones des deux côtés du ganglion, ce qui rend plus facile et plus efficace d'identifier les neurones multiples dans la même préparation. Troisièmement, extracellulairelar électrodes n'ont pas besoin de pénétrer dans les cellules, et peuvent donc être facilement déplacé d'avant en arrière entre les neurones, ce qui provoque moins de dégâts à eux. Ceci est particulièrement utile quand on essaie d'enregistrer plusieurs neurones au cours de la répétition des schémas moteurs qui ne peuvent persister pendant quelques minutes. Quatrièmement, les électrodes extracellulaires sont plus souples que celles intracellulaires lors des mouvements musculaires. Électrodes intracellulaires peuvent sortir et endommager les neurones pendant les contractions musculaires. En revanche, depuis électrodes extracellulaires sont légèrement pressés sur la gaine au-dessus de neurones, ils restent habituellement au-dessus du même neurone pendant les contractions musculaires, et peut donc être utilisé dans plusieurs préparations intactes.

Pour identifier les neurones moteurs pour un parc de véhicules (en particulier, le muscle chez l'aplysie I1/I3) en utilisant des électrodes extracellulaires, on peut utiliser des fonctionnalités qui ne nécessitent pas de mesures intracellulaires comme critères: la taille et l'emplacement soma, la projection axonale et l'innervation muscle ⁴, 6,7. Pour le parc de véhicules particulier utilisé pour illustrer la technique, nous avons enregistré des nerfs buccaux 2 et 3 pour mesurer projections axonales, et mesuré les forces de contraction du muscle I1/I3 pour déterminer le modèle de l'innervation musculaire pour les neurones moteurs individuels.

Nous démontrons le processus complet des premiers neurones moteurs identifier en utilisant l'innervation musculaire, puis la caractérisation de leur temps au cours de la motricité, la création d'une méthode simplifiée de diagnostic pour l'identification rapide. Le procédé plus simple et plus rapide de diagnostic est supérieure à la préparation plus intactes, par exemple dans la préparation de masse buccale suspendu ⁸ ou ⁹ in vivo. Ce procédé peut aussi être appliqué dans les piscines à moteur autres ^10,11,12 chez l'aplysie ou dans des systèmes animaux autres ^2,3,13,14.

Protocol

1. Préparation de la vaisselle d'enregistrement

1. Au cours des expériences transducteur de force, les ganglions buccale, ganglion cérébral, et la masse buccale sont placés dans un plat rond en pyrex qui est spécialisé pour les études de la force.
2. Pour induire ingestion motifs en forme dans les expériences, nous avons besoin d'appliquer le carbachol non hydrolysable agoniste cholinergique du ganglion cérébral ^15. Pour éviter le contact direct de carbachol sur les noyaux vestibulaires et la masse buccale, chambres séparées sont nécessaires pour isoler le ganglion cérébral des ganglions buccale et la masse buccale (figure 1)....

Results

Les figures 4 et 5 montrent des résultats typiques utilisés pour identifier deux I1/I3 neurones moteurs. Figure 4 montre les enregistrements soma d'un grand neurone moteur, B3, pendant modèles egestive-like et ingestion de type (4C chiffres, 4D). L'un pour-un des pics correspondant sur ​​le canal et le canal de soma ipsilatérale BN2 (figure 4E) montrent que la spécificité de B3 soma enregistrement a été maintenue pendant modèles. B3 feu.......

Discussion

Chez les animaux avec de grands neurones identifiés, tels que les mollusques (par exemple, Lymnaea, Helix, et Aplysia), l'analyse des piscines moteur est généralement fait en utilisant un enregistrement intracellulaire ^1,2,3,4. Dans ce protocole, nous décrivons un processus pour identifier de manière unique les neurones moteurs pour un parc automobile en utilisant une technique extracellulaire. Nous avons utilisé les mesures de force comme une illustration de ce processus. On pourrait au.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
De chlorure de sodium	Fisher Scientific	S671	Biologique, certifié
Le chlorure de potassium	Fisher Scientific	P217	Certifié ACS
Chlorure de magnésium hexahydraté	Acros Organics	19753	99%
Sulfate de magnésium heptahydraté	Fisher Scientific	M63	Certifié ACS
Chlorure de calcium dihydraté	Fisher Scientifique	C79	Certifié ACS
Le glucose (dextrose)	Sigma-Aldrich	G7528	BioXtra
MOPS Buffer	Acros Organics	17263	99%
Carbachol	Acros Organics	10824	99%
L'hydroxyde de sodium	Fisher Scientific	SS255	Agréé
Acide chlorhydrique	Fisher Scientific	SA49	Agréé
Seul canon capillaire en verre	Systèmes AM	6150
Flaming-Brown micropipette extracteur modèle P-80/PC	Sutter Instruments		Incandescence: FT345B
Émail fil revêtu d'acier inoxydable	Californie Fine Wire		0.001D, revêtement h
Des ménages Silicone II Colle	GE
Duro-Gel colle rapide	Henkel corp.
AM amplificateur Systems Modèle 1700	Systèmes AM		Les paramètres de filtre: 10-500 Hz pour le nerf I2 / muscle; 300-500 Hz pour tous les autres nerfs
Pulsemaster Multi-Channel Stimulator	World Precision Instruments	A300
Isolateur de stimulation	World Precision Instruments	A360
X AxoGraph	AxoGraph scientifique		Logiciel pour les enregistrements
Broches du connecteur Or	Bulgin	SA3148 / 1
Gold Connector Sockets	Bulgin	SA3149 / 1
Elastomère silicone Sylgard 184	Dow Corning
Boîte de 100 x 15 mm cristalliser	Pyrex
Graisse à vide élevé	Dow Corning
Conseils Pipet	Fisher Scientific	21-375D
Pins minuties	Outils Fine Science	26002-10
Pâte à modeler	Sargent Art	22-4400
Chuchoter pompe à air	Tetra	77849
Tuyau d'aquarium	Eheim	7783	12/16 mm
Elite Diffuseur	Hagen	A962
Vannas Ciseaux Spring	Outils Fine Science	15000-08
Dumont # 5 pinces fines	Fin SciencOutils électroniques	11254-20
Kimwipes	Kimberly-Clark	34155