Extracellularly의 근육 모터 풀에 모터 뉴런을 확인<em> Aplysia californica</em
Summary
대형 식별 뉴런 (과 동물<em> 예</em> mollusks), 모터 풀의 분석은 세포 기술을 사용하여 수행됩니다<sup> 1,2,3,4</sup>. 최근, 우리는 extracellularly에서 개별 뉴런을 자극하고 기록 할 수있는 기술을 개발<em> Aplysia californica</em<sup> 5</sup>. 이제 우리는 고유 식별하고 모터 수영장에서 모터 뉴런을 특성화하기 위해이 기술을 사용하기위한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
대형 식별 뉴런 (예 : mollusks), 모터 풀의 분석과 동물에서 세포 기술에게 1,2,3,4를 사용하여 수행됩니다. 최근, 우리는 extracellularly 자극하고 Aplysia californica 5 개별 뉴런을 기록 할 수있는 기술을 개발했습니다. 이제 우리는 고유 식별하고 모터 수영장에서 모터 뉴런을 특성화하기 위해이 기술을 사용하기위한 프로토콜을 설명합니다.
이 세포 기술은 장점이 있습니다. 첫째, 세포 전극은 자극하고 기록 뉴런을 피복 1-5하므로 제거 할 필요가 없습니다 수 있습니다. 따라서, 뉴런은 세포들보다 세포 실험에서 건강하게 될 것입니다. 둘째, 신경절 경우하면 집에 걸어주는 적절한하여 회전은, 세포 전극은 쉽고 효율적으로 같은 준비에서 여러 뉴런을 식별 할 수 신경절의 양쪽 뉴런에 액세스 할 수 있습니다. 셋째, extracellu고맙다 전극은 세포를 통과 할 필요가 없습니다, 그래서 쉽게 그들에게 더 적은 손상을 초래 뉴런 사이에 앞뒤로 이동할 수 있습니다. 하나가 단 몇 분 거리에 지속될 수 있습니다 모터 패턴을 반복하는 동안 여러 뉴런을 기록하려고 할 때 특히 유용합니다. 넷째, 세포 전극은 근육 운동 기간 동안 세포들보다 더 유연합니다. 세포 내 전극 꺼내 근육 수축 동안 뉴런가 손상 될 수 있습니다. 세포 전극이 부드럽게 뉴런 위의 집에 눌러되므로 대조적으로, 그들은 일반적으로 근육의 수축시 동일한 뉴런 위 유지, 따라서 더 많은 손상 준비에 사용할 수 있습니다.
소마 크기와 위치, axonal 프로젝션, 그리고 근육 innervation 4 : 고유 세포 전극을 사용하여 모터 풀 (특히, Aplysia의 I1/I3 근육)에 모터 뉴런을 식별하려면, 하나는 기준으로 세포 측정을 필요로하지 않는 기능을 사용할 수 있습니다, 6,7. 기술을 설명하는 데 사용되는 특정 모터 풀의 경우, 우리는 axonal 예측을 측정하기 위해 구강 신경에서 2, 3를 기록하고, 각각의 모터 뉴런에 근육 innervation의 패턴을 결정하기 위해 I1/I3 근육의 수축 힘을 측정.
우리는 빠른 식별을위한 단순화 된 진단 방법을 만들어, 모터 패턴 중에 타이밍을 특성화, 근육 innervation을 사용하여 첫번째 식별 모터 뉴런의 전체 과정을 보여줍니다. 간체 및 더 빠른 진단 방법은 정지 구강 대량 준비 8 또는 생체 9 예를 들어, 더 많은 손상 준비를위한 우수합니다. 이 과정은 2,3,13,14 Aplysia 또는 다른 동물 시스템에서 10,11,12 다른 모터 수영장에서 적용 할 수 있습니다.
Protocol
1. 녹화 요리의 작성 힘 변환기 실험 기간 동안, 구강 신경절, 뇌성 신경절 및 구강 질량 힘 연구에 대한 전문되는 원형 Pyrex 요리에 배치되어 있습니다. 실험에 ingestive 같은 패턴을 유도하기 위해, 우리는 대뇌 신경 15 비 hydrolyzable cholinergic 작용제의 carbachol를 적용해야합니다. 구강 신경절 및 구강 대량 위에 carbachol의 직접 접촉을 방지하기 위해, 별도의 챔버는 구강 신?…
Representative Results
그림 4와 5는 두 I1/I3 모터 뉴런을 식별하는 데 사용되는 일반적인 결과를 보여줍니다. 그림 4 egestive 같은과 ingestive 같은 패턴 (인물 4C, 4D) 동안 대형 모터 뉴런, B3의 소마 녹음을 보여줍니다. 일대일의 소마 채널 및 B3 소마 기록의 특이성이 패턴 동안 유지되었다는 ipsilateral BN2 채널 (그림 4E) 쇼에 해당하는 스파이크. B3는 패턴의 중간 – 투 – 늦은 ?…
Discussion
예 mollusks (예를 들어, Lymnaea, 나선형, 그리고 Aplysia), 모터 풀의 분석과 같은 대형 식별 뉴런과 동물에서 일반적으로 세포 내 기록 1,2,3,4를 사용하여 수행됩니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 고유 세포 기술을 사용하여 모터 풀의 모터 뉴런을 식별하기위한 프로세스에 대해 설명합니다. 우리는이 과정을 그림으로 힘 측정을 사용했습니다. 하나는 또한 근육 innervations를 측정하?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 NIH 보조금 NS047073 및 NSF 보조금 DMS1010434에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671 | Biological, Certified |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 | Certified ACS |
| Magnesium chloride hexahydrate | Acros Organics | 19753 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63 | Certified ACS |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientifc | C79 | Certified ACS |
| Glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | BioXtra |
| MOPS buffer | Acros Organics | 17263 | 99% |
| Carbachol | Acros Organics | 10824 | 99% |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS255 | Certified |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Certified |
| Single-barreled capillary glass | A-M Systems | 6150 | |
| Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC | Sutter Instruments | Filament used: FT345B | |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE | ||
| Duro Quick-Gel superglue | Henkel corp. | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings: 10-500 Hz for the I2 nerve/muscle; 300-500 Hz for all the other nerves | |
| Pulsemaster Multi-Channel Stimulator | World Precision Instruments | A300 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| AxoGraph X | AxoGraph Scientific | Software for recordings | |
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow Corning | ||
| 100 x 15 mm Crystalizing Dish | Pyrex | ||
| High Vacuum Grease | Dow Corning | ||
| Pipet Tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4400 | |
| Whisper Air Pump | Tetra | 77849 | |
| Aquarium Tubing | Eheim | 7783 | 12/16 mm |
| Elite Airstone | Hagen | A962 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 |
References
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Citer Cet Article
Lu, H., McManus, J. M., Chiel, H. J. Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (73), e50189, doi:10.3791/50189 (2013).