Extracelularmente Identificar os neurônios motores de um pool do motor muscular em<em> Aplysia californica</em
Summary
Em animais com grandes neurônios identificados (<em> Por exemplo</em> Moluscos), análise de piscinas do motor é feita usando técnicas intracelulares<sup> 1,2,3,4</sup>. Recentemente, desenvolveu uma técnica para extracelularmente estimular e registrar neurônios individuais em<em> Aplysia californica</em<sup> 5</sup>. Vamos agora descrever um protocolo para usar esta técnica para identificar e caracterizar os neurônios motores dentro de um pool do motor.
Abstract
Em animais com grandes neurónios identificados (por exemplo, os moluscos), análise de pools de motor é feita utilizando técnicas intracelulares 1,2,3,4. Recentemente, desenvolveu uma técnica para extracelularmente estimular e registrar os neurônios individuais em Aplysia californica 5. Vamos agora descrever um protocolo para usar esta técnica para identificar e caracterizar os neurônios motores dentro de um pool do motor.
Esta técnica tem as vantagens extracelular. Em primeiro lugar, os eléctrodos extracelulares pode estimular e registrar os neurónios através da bainha 5, de modo que não necessita de ser removido. Assim, os neurônios será mais saudável em experimentos extracelulares que nas intracelulares. Em segundo lugar, se os gânglios são girados por fixação adequada da bainha, eléctrodos extracelulares pode acessar neurónios em ambos os lados do gânglio, o que torna mais fácil e mais eficiente para identificar neurónios múltiplos na mesma preparação. Em terceiro lugar, extracelularlar eléctrodos não precisam de penetrar nas células e, portanto, pode ser facilmente deslocado para trás e para a frente entre os neurónios, causando menor dano a eles. Isto é especialmente útil quando se tenta gravar neurônios múltiplos durante repetindo padrões motores que só podem persistir por minutos. Em quarto lugar, os eléctrodos extracelulares são mais flexíveis do que os intracelulares durante os movimentos musculares. Eletrodos intracelulares pode tirar e danificar neurônios durante as contrações musculares. Em contraste, uma vez que os eléctrodos extracelulares são suavemente pressionada contra a bainha acima neurónios, que normalmente ficam acima do mesmo neurónio durante as contracções musculares, e assim pode ser usado em preparações mais intactos.
Para identificar os neurônios motores de um pool do motor (em particular, o músculo I1/I3 em Aplysia) através de eletrodos extracelulares, pode-se usar recursos que não requerem medições intracelulares como critérios: soma de tamanho e localização, projeção axonal, e inervação muscular 4, 6,7. Para o conjunto de motor em particular utilizados para ilustrar a técnica, a partir dos nervos bucais gravado 2 e 3 para medir projecções axonais e mediram as forças de contracção do músculo I1/I3 para determinar o padrão de inervação do músculo para os neurónios motores individuais.
Demonstramos o processo completo de primeiro identificação de neurónios motores que utilizam a inervação do músculo, em seguida, caracterizando a sua temporização durante padrões motores, a criação de um método simplificado de diagnóstico para a identificação rápida. O método simplificado e mais rápido para o diagnóstico é superior para as preparações mais intactas, por exemplo, na preparação de massa suspensa bucal 8 ou 9, in vivo. Este processo também pode ser aplicado em conjuntos de motor que, em Aplysia 10,11,12 ou em outros sistemas animais 2,3,13,14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Em animais com grandes neurónios identificados, tais como moluscos (por exemplo, Lymnaea, Helix e Aplysia), análise de piscinas do motor é geralmente feita usando gravação intracelular 1,2,3,4. Neste protocolo, descrevemos um processo para identificar individualmente os neurônios motores de um pool do motor utilizando uma técnica extracelular. Usamos as medidas de força como uma ilustração desse processo. Pode-se também usar EMG para medir inervações musculares. Resumidamente, p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pelo NIH concessão NS047073 e concessão do NSF DMS1010434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671 | Biological, Certified |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 | Certified ACS |
| Magnesium chloride hexahydrate | Acros Organics | 19753 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63 | Certified ACS |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientifc | C79 | Certified ACS |
| Glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | BioXtra |
| MOPS buffer | Acros Organics | 17263 | 99% |
| Carbachol | Acros Organics | 10824 | 99% |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS255 | Certified |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Certified |
| Single-barreled capillary glass | A-M Systems | 6150 | |
| Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC | Sutter Instruments | Filament used: FT345B | |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE | ||
| Duro Quick-Gel superglue | Henkel corp. | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings: 10-500 Hz for the I2 nerve/muscle; 300-500 Hz for all the other nerves | |
| Pulsemaster Multi-Channel Stimulator | World Precision Instruments | A300 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| AxoGraph X | AxoGraph Scientific | Software for recordings | |
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow Corning | ||
| 100 x 15 mm Crystalizing Dish | Pyrex | ||
| High Vacuum Grease | Dow Corning | ||
| Pipet Tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4400 | |
| Whisper Air Pump | Tetra | 77849 | |
| Aquarium Tubing | Eheim | 7783 | 12/16 mm |
| Elite Airstone | Hagen | A962 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 |
References
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