Isolasjon og differensiering av stromale Vaskulær Cells til beige / Brite Cells
Summary
Primære hvite preadipocytes isolert fra hvite fettvev hos mus kan differensieres i beige / brite celler. Presenteres her er en pålitelig mobilnettet modellsystem for å studere molekylære reguleringen av "bruning" av hvitt fett.
Abstract
Brune adipocytter har evnen til Koble fra respiratoriske kjeden i mitokondriene og spre kjemisk energi som varme. Utvikling av UCP1-positive brune adipocytter i hvite fettvev (såkalt beige eller Brite celler) er sterkt indusert av en rekke miljømessige signaler som kronisk kulde eller ved PPARγ agonister, derfor har denne celletype potensial som et terapeutisk mål for fedme behandling. Selv om de fleste udødeliggjort adipocyte linjer ikke kan rekapitulere prosessen med "bruning" av hvitt fett i kultur, primære adipocytter isolert fra stromal vaskulær fraksjon i subkutan hvitt fettvev (WAT) gir en pålitelig mobilsystemet å studere molekylære kontroll av beige / brite celle utvikling . Her beskriver vi en protokoll for effektiv isolering av primære preadipocytes og for å indusere differensiering til beige / Brite celler i kultur. Bruning effekten kan vurderes ved uttrykket av brunt fett-selektiv markere som UCP1.
Introduction
Fedme er dramatisk økende over hele verden og er nå regnet som en av de mest alvorlige bekymringer til folkehelsen en. Dette forholdet er knyttet til en misbalance i energiinntak i forhold til utgifter og resultater i overskuddsenergi lagres som fett i hvitt fettvev (WAT). Forstørret WAT er assosiert med økt kroppsmasse og vekt, samtidig som brunt fettvev har evnen til å spre overskuddsenergi å produsere varme. Derfor BAT kan fungere som beskyttelse mot både kulde og fedme 2,3. Dette oppnås ved frakobling av elektrontransportkjeden i mitokondriene av uncoupling protein 1 (UCP1). Dette proteinet er ansett som en kjennetegn for nonshivering termotilblivelsen i BAT 3. Flere studier de siste årene avdekket at voksne mennesker har funksjonell BAT 4-8 og dermed kan manipulering av BAT hos mennesker være en potensiell terapeutisk intervensjon i kampen mot fedme og relaterte sykdommer.
jove_content "> Aktuelt bevis indikerer at to typer brune fettceller eksisterer hos gnagere," klassisk "eller" pre-eksisterende "brunt fett utvikles under prenatal scenen og danner dedikert brune adipose depoter i interscapular regionen og andre perifere vev På den annen side. , en "induserbar" form av brunt fett (såkalt brite eller beige celler) utvikler seg etter fødselen scenen og vises utblandet i hvite fettvev. De to typene brune fettceller er også delt av ulike utviklingsmessige opprinnelse. Mens pre-eksisterende oppstår brune fettceller fra myoblastsic-lignende Myf5 forløpere, de induserbare brite / beige celler utblandet i WAT oppstå fra en ikke-Myf5 avstamning 9,10. I tillegg er regulatoriske trasé av denne celletypen trolig være forskjellig fra Myf5-derived brun adipocytter 11. Utviklingen av beige celler (dvs. "bruning" av hvitt fett) kan aktiveres i respons til kronisk kulde og tilβ3-adrenoseptor-agonister eller PPARγ agonister hos voksne 12-14. De beige / brite celler er sannsynlig å være en lovende terapeutisk mål for manipulering av totale energibalansen og kan potensielt bli en del av fedme behandling, derfor er det viktig å forstå nøyaktig molekylære mekanismer og signalveier der miljømessige signaler styrer utviklingen av beige celler.For å forstå den molekylære kontroll av bruning av hvitt fett, er in vitro eksperimenter best egnet som differensiering av preadipocytes foregår heller asynkront og det er vanskelig å oppdage cellene in situ 15. Selv om studier på adipocyte utvikling hittil er utført i hovedsak på cellelinjer som 3T3-L1, 3T3-F442A eller HIB1, disse cellelinjer synes å mangle den molekylære signaturen beige celler. På den annen side, primære adipocytter isolert fra subkutan WAT er mest sannsynlig å rekapitulere forarbeides of bruning av hvitt fett i en celle autonome mote. Her har vi gi en protokoll for effektiv isolering av stromale vaskulære fraksjonen fra fettvev og for å indusere bruning av hvitt fett i respons til PPARγ agonister. Rosiglitazon har vist seg å være et spesielt effektivt formidler av bruning i disse celler. Som tidligere antydet 16, kan dette mobilsystemet brukes til å tjene et pålitelig mobilsystemet for å studere utviklingen av beige / Brite celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her presenterer vi en pålitelig mobilsystemet å studere utviklingen av beige / brite celler i primære dyrkede adipocytter i mus. Som sammenlignet med flere tilgjengelige udødeliggjort cellelinjer, er dette systemet sannsynligvis tilby forbedret relevans til bruning av hvitt fett in vivo.
Selv om studien av disse primære adipocytter har noen fordeler, det også finnes noen begrensninger og bekymringer som er viktige å vurdere. Først, er dette systemet svært avhengige differen…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Haruya Ohno, Kosaku Shinoda, Louis Sharp, Emi Tomoda, og Lauren Ruiz for diskusjon, teknisk hjelp og redaksjonell bistand på manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra NIH (DK087853), fra Program for Breakthrough biomedisinsk forskning og fra Asubio Pharm Inc. til SKULA ble støttet av en aksje Stipendiater fra Københavns Universitet og EU FP7-prosjektet Diabat (HELSE-F2 -2011 til 278373) til Lise Madsen og Karsten Kristiansen. Vi erkjenner også DERC sentrum tilskuddet (NIH P30 DK063720).
Materials
| Reagent | |||
| Collaginase D | Roche | 11088874103 | |
| Dispase II | Roche | 04942078001 | |
| CaCl2 | |||
| DMEM medium | Fisher | 10017-CV | With 2,5 g/l glucose & L-glutamine without sodium pyruvate |
| Insulin | |||
| T3 (3,3′,5-Triiodo-L-thyronine) | Sigma | T-2877 | |
| Indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| Dexamethasone | Sigma | D-1756 | |
| IBMX | Sigma | I-5879 | |
| Rosiglitazone | Sigma | R-2408 | |
| Equipment | |||
| Collagen coated dishes | BD | 354450 | 10 cm plates |
| 70 μm filter | BD Falcon | 352350 | Cell strainer,70 μm nylon 1/ea |
References
- Barness, L. A., Opitz, J. M., Gilbert-Barness, E. Obesity: genetic, molecular, and environmental aspects. American Journal of Medical Genetics. Part A. 143A, 3016-3034 (2007).
- Rothwell, N. J., Stock, M. J. Combined effects of cafeteria and tube-feeding on energy balance in the rat. The Proceedings of the Nutrition Society. 38, 5A (1979).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360, 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360, 1500-1508 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360, 1518-1525 (2009).
- Zingaretti, M. C., et al. The presence of UCP1 demonstrates that metabolically active adipose tissue in the neck of adult humans truly represents brown adipose tissue. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 3113-3120 (2009).
- Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58, 1526-1531 (2009).
- Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454, 961-967 (2008).
- Petrovic, N., et al. Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2010).
- Coulter, A. A., Bearden, C. M., Liu, X., Koza, R. A., Kozak, L. P. Dietary fat interacts with QTLs controlling induction of Pgc-1 alpha and Ucp1 during conversion of white to brown fat. Physiological Genomics. 14, 139-147 (2003).
- Klingenspor, M. Cold-induced recruitment of brown adipose tissue thermogenesis. Experimental Physiology. 88, 141-148 (2003).
- Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, leukotrienes, and essential fatty acids. 73, 9-15 (1016).
- Ghorbani, M., Himms-Hagen, J. Appearance of brown adipocytes in white adipose tissue during CL 316,243-induced reversal of obesity and diabetes in Zucker fa/fa rats. International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders: Journal of the International Association for the Study of Obesity. 21, 465-475 (1997).
- Hansen, J. B., Kristiansen, K. Regulatory circuits controlling white versus brown adipocyte differentiation. The Biochemical Journal. 398, 153-168 (2006).
- Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M., Kajimura, S. PPARy agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein. Cell metabolism. 15, 395-404 (2012).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15, 480-491 (2012).
- Cinti, S. Transdifferentiation properties of adipocytes in the adipose organ. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E977-E986 (2009).
- Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 298, E1244-E1253 (2010).
- Petrovic, N., et al. Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2009).
- Rong, J. X., et al. Adipose mitochondrial biogenesis is suppressed in db/db and high-fat diet-fed mice and improved by rosiglitazone. Diabetes. 56, 1751-1760 (2007).
- Wilson-Fritch, L., et al. Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone. The Journal of Clinical Investigation. 114, 1281-1289 (2004).
- Sell, H., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonism increases the capacity for sympathetically mediated thermogenesis in lean and ob/ob mice. Endocrinology. 145, 3925-3934 (2004).
- Fukui, Y., Masui, S., Osada, S., Umesono, K., Motojima, K. A new thiazolidinedione, NC-2100, which is a weak PPAR-gamma activator, exhibits potent antidiabetic effects and induces uncoupling protein 1 in white adipose tissue of KKAy obese mice. Diabetes. 49, 759-767 (2000).
- Vernochet, C., et al. C/EBPalpha and the corepressors CtBP1 and CtBP2 regulate repression of select visceral white adipose genes during induction of the brown phenotype in white adipocytes by peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists. Molecular and Cellular Biology. 29, 4714-4728 (2009).
- Tai, T. A., et al. Activation of the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor gamma promotes brown adipocyte differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 271, 29909-29914 (1996).
- Sugii, S., et al. PPARgamma activation in adipocytes is sufficient for systemic insulin sensitization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 22504-22509 (2009).
