延时成像的主要癌前乳腺上皮细胞来源于遗传工程小鼠乳腺癌模型
Summary
时间延时成像是用来评估初级癌前来自乳腺癌风险遗传工程小鼠模型，以确定是否有特定的行为参数之间的相关性和不同的遗传病变的乳腺上皮细胞的行为。
Abstract
延时成像可以用来比较原代培养的癌前来自不同的遗传工程小鼠模型的乳腺癌的乳腺上皮细胞的行为。例如，之间的时间（电池寿命）的细胞分裂，凋亡细胞的数量，进化形态的变化，和集落形成机制，可以量化和比较携带特定遗传病变的细胞。原发性乳腺上皮细胞培养物产生的未扪及肿瘤的乳腺。有明确的分离从邻近的肌肉，仔细切除腺体，淋巴结被删除，和切碎的乳腺组织，然后用酶解和过滤所产生的丰富的乳腺上皮细胞的单细胞悬液。单细胞悬液，接种和内直接放置在显微镜下活细胞成像的孵化室。十六个650微米×700微米领域的一个4×4的配置每一个W埃尔的6孔板中的成像，每15分钟，连续5天。时间推移的影像检查，直接测量细胞的行为，可以包括细胞集落形成的机理和频率范围内的第一个24小时的电镀细胞（聚集与细胞增殖），细胞凋亡的发生率，并逐步形态的变化。单细胞跟踪是用来产生用于测量个别细胞寿命和调查的细胞分裂模式的细胞命运地图。定量数据进行统计分析，以评估与特定的遗传病变显着的行为差异。
Introduction
遗传工程小鼠模型的工具来研究和了解不同的遗传病变患乳腺癌的风险。例如，已经表明，遗传工程小鼠的三个因素的结合：损失的全长1，乳腺癌发病初期（BRCA1基因 ）在乳腺上皮细胞中的基因，肿瘤蛋白p53（TP53）种系单倍剂量不足，和乳腺上皮细胞靶向上调雌激素受体α（ERA）的表达在乳腺癌的发展，在100％的BRCA1基因两侧装接loxP（F）11/f11/Mouse乳腺肿瘤病毒（MMTV）-Cre/p53 + / -/tetracycline-operator（ TET-运）-ER/MMTV-reverse“四环素反式激活（rtTA 12个月的年龄在小鼠相比，比例较低报道的 BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / –小鼠没有时代的过度表达（约50 – 60％）和BRCA1基因f11/f11/MMTV-Cre没有TP53 haploinsuf的小鼠效率（<5％）。
癌前原发性乳腺上皮细胞的行为的动态时间推移成像揭示在细胞的行为差异，在静态的组织切片，不太容易理解。在细胞增殖和分化的改变主要观察乳腺细胞从人类BRCA1基因突变携带者。2创造的单细胞悬液，主要从正常乳腺上皮细胞和基因工程小鼠产生切除的乳腺组织通过酶的解离。时间的推移观看影像，以评估机制和时机的细胞集落的外观和细胞的形态学变化包括上皮 – 间质转化（EMT）和细胞凋亡的发生率。细胞命运的图的生成，促进细胞分裂（电池寿命），并且确定的细胞分裂的模式之间的时间的长度的定量通过使用单细胞的跟踪。蒂姆“跟踪工具（TTT）是公开可用的软件，用于生成单细胞的命运地图。其效用在阐明细胞命运的机制已经建立4,5检查正常造血干细胞发育6-9和神经元的产生。
Protocol
Representative Results
Discussion
关键步骤
重要的是要确保从小鼠同年龄控制在乳腺上皮细胞的行为与年龄有关的变化，乳腺腺体的收获。当镀敷的细胞，细胞的相同数目的应被镀在各孔中，为每一个实验。细胞应该是相对稀疏时，镀敷，使文化不成为汇合太快使得可以按照多个单独的细胞通过串行图像。至关重要的是，该板是在孵化器中平衡，因为焦点成像之前将更改后的板平衡。一次成像已经开始，应经常…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢“博凡吴基督教Raithel的为他介绍活细胞成像技术援助和迈克尔·丽格。由国家癌症研究所，美国国立卫生研究院RO1CA112176（PAF），美国国立癌症研究所，美国国立卫生研究院支持。 R01CA89041-10S1（PAF），，丁斯特的EV A/09/72227编号德国学术Austaush。 316（REN），国防部W81XWH-11-1-0074（REN），WCU（世界一流大学）计划，通过教育，科学和技术部（R31-10069）由韩国国家研究基金会（PAF ），美国国立卫生研究院IG20 RR025828-01（啮齿动物屏障设施设备），和，NIH：NCI 5P30CA051008（显微镜和影像和动物共享资源）。
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| EpiCult-B Basal Medium Mouse | StemCell Technologies | 05610 | |
| EpiCult-B Proliferation Supplements Mouse | StemCell Technologies | 05612 | |
| recombinant human Epidermal Growth Factor (rhEGF) | StemCell Technologies | 02633 | |
| Collagenase/Hyaluronidase | StemCell Technologies | 07912 | |
| Disposable Scapels | Feather | 2975#10 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | StemCell Technologies | 37150 | |
| Ammonium Chloride | StemCell Technologies | 07800 | |
| Tryspin-EDTA | StemCell Technologies | 07901 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 07913 | |
| DNase I | StemCell Technologies | 07900 | |
| 40 μm cell strainer | StemCell Technologies | 27305 | |
| FBS | StemCell Technologies | 06100 | |
| PenStrep | Gibco | 15140 |
References
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