来自患者的细胞培养和分离的CD133<sup> +</sup>假定的肿瘤干细胞的恶性黑色素瘤
Summary
本文介绍了准备的新鲜获得的原代细胞培养，以及如何去除污染的红细胞和成纤维细胞的肿瘤细胞的黑色素瘤组织到。最后，我们介绍了如何CD133<sup> +</sup>假定黑色素瘤干细胞的CD133排序<sup-</sup>批量使用磁性细胞分选（MACS）。
Abstract
尽管改进治疗方法的选择黑色素瘤的今天，晚期恶性黑色素瘤患者的无进展生存和总体生存的预后较差。因此，翻译研究的需要，以改善恶性黑色素瘤的靶向治疗提供进一步的分子生物学证据。在过去，致癌黑色素瘤有关的机制在已建立的细胞系中进行了广泛的研究。在个人基因图谱的基础上，以更加个性化的治疗方案，我们建议使用患者来源的细胞系，而不是普通的细胞株。再加上高品质的临床数据，尤其是在患者随访，这些细胞将有助于更好地理解背后的分子机制黑色素瘤的进展。
在这里，我们报告的原发性黑色素瘤的解剖新鲜肿瘤组织文化的建立。此过程包括切碎的组织分离成单个细胞，再moval与红细胞和成纤维细胞的原代培养细胞的黑色素瘤起源和可靠的核查以及污染。
最近的报告表明，多数肿瘤，黑色素瘤，如港口小亚群的肿瘤干细胞（CSCs），这似乎是专门推动肿瘤的发生和发展对转移状态。 CSC在黑色素瘤的识别和隔离的关键指标之一是CD133。隔离CD133 +干细胞从原发黑色素瘤的文化，我们修改和优化，磁激活细胞分选（MACS）从美天旎程序导致排序纯度高和活力的CD133 +干细胞，CD133 –散装，它可以培育和功能分析此后。
Introduction
皮肤恶性黑色素瘤是最常见的，也是最致命的皮肤癌类型。由于发病率越来越高，一个高品位的恶性和快速的传播，恶性黑色素瘤占75％的恶性皮肤肿瘤相关死亡1,2。除了 手术切除原发肿瘤，化疗，放疗，免疫治疗和化疗和免疫治疗转移性黑色素瘤是国家的最先进的黑色素瘤的治疗策略，3,4。然而，恶性黑色素瘤的特点是对化疗药物的反应不佳（5-12％）5,6，和只有50％-70％的恶性黑色素瘤患者携带BRAF V600E基因突变的好处有前途的新的靶向治疗药物的治疗vemurafenib 7提高总生存率，更好地了解黑色素瘤肿瘤的机制是必要的。
为了研究这些机制在过去，完善的市售单独购买可用的细胞株。利用最近的方法来研究癌症的发生和发展的分子事件的主要直接来源于肿瘤组织的文化 – 一种策略轴承多方面的好处：研究者具有完全控制的患者和组织的选择。采样的细胞获得的专业选择肿瘤组织的肿瘤，像所有的异质性，对病人的随访数据和详细的病理是允许的文化进行比较的特点与原发肿瘤8。
与此相反，在癌症研究中作为相关的模型系统的建立的细胞系的使用有争议的讨论。早在1987年，奥斯本和他的同事们描述了来自不同实验室9人乳腺癌MCF-7细胞株显着的生物差异。这种广泛的基因组不稳定性，在传代过程中RNA的表达变化合作nfirmed由Hiorns 等，并提供证据表明，细胞系在培养演变，从而削弱了这种既定文化作为人类癌症10的模型直接相关的数据支持。
多年来，这在很大程度上被忽视了，是另一个重要的考虑无关的'假'的细胞，这是第一次在20年前通过展示突出文化与污染或过度生长的风险，大量被污染的细胞系HeLa细胞细胞8,11。误解'假'细胞株的数据，最近在文献中再次暴露出来。使用DNA分析和分子细胞遗传学的结合，MacLeod 等人发现，252个新的人类肿瘤源性细胞株存放在德国收集的微生物和细胞培养（DSMZ），近18％被认为是种内或种间杂种污染物12,13。
为了避免这些问题，并利用上述的优点，我们决定建立低传代新鲜切除转移的黑色素瘤细胞系。
同时限制细胞的死亡和破坏特征的表面蛋白单细胞的准备工作，以产生强大的细胞分离和分析技术。台式仪器的自动分离成单细胞悬液组织是由美天旎制造gentleMACS离解。当使用结合gentleMACSÇ管和优化的解离的解决方案，在一个封闭的系统中的肿瘤组织的一个有效和温和解离来实现，同时保留抗原表位，并减少信元丢失。该仪器提供了优化，预先设定的程序的各种特定的应用程序和担保标准化制备单细胞悬浮液从黑色素瘤组织14。
<P类=的“jove_content”>最近的报告表明，多数肿瘤怀有小亚群所谓的肿瘤干细胞（CSCs），只表现出肿瘤的启动和自我更新的能力。的皮肤的真皮层中的黑素细胞产生的干细胞的识别导致的假设，即这些细胞可能会对在黑素瘤中的肿瘤干细胞（CSCs）的起源，因为暴露于紫外线辐射可以灌注，这些细胞的恶性转化15。这种遗传病变的结果将是怀有相结合的肿瘤干细胞特性的细胞。建议在黑色素瘤干细胞亚群的代表的关键标志物之 一是CD133的16-20。 CD133（也称为作为Prominin 1），一个部件的pentaspan跨膜糖蛋白，是表示，在造血干细胞，血管内皮祖细胞，神经元和神经胶质干细胞21-23。 CD133表达与不对称细胞分裂24，以及被证明是糖基化的抗原表位的CD133下调细胞分化时25。最近，CD133 +黑色素瘤细胞具有自我更新和肿瘤起始容量19,20。
为了研究CD133 +公认的黑色素瘤干细胞的功能，我们修改和优化的磁性活化细胞分选系统（MACS）从美天旎生物技术获得的丰富和可存活种群的CD133 +和CD133 –细胞。
基于磁珠细胞分离可以是负选择Matheu 等 26或积极的选择，我们在这里展示。阳性选择的过程的特定的靶细胞类型， 例如 CD133的表达细胞，微珠，50-nm的超顺磁性粒子，是共轭高度特异性抗体针对磁标记特定的细胞表面抗原。分离过程中，磁标记的细胞被保留在柱中，在磁场中的隔板，而标记的细胞流经。洗涤步骤之后，该列被删除从磁场的分离器，和靶细胞，从柱中洗脱。 LS或使用MS列的分数高纯度的标记和未标记的细胞阳性选择的过程。另一方面，LD列，用于负选择，导致稍微低的纯度的标记的部分。由于它们的矩阵变浓的包装在这些列中的流速是低级所得在被困在列中的未标记细胞的风险较高。 LD列，因此，应仅用于不需要的细胞亚群的严格耗尽。可以通过直接（耦合到微珠的抗体）或间接的磁性标记（孵化后incubatio与微珠的阳性筛选n与第一抗体）。具体MACS微珠可用于许多类型的细胞的阳性筛选原发性肿瘤细胞，如前列腺癌或黑素瘤27。
Protocol
Representative Results
Discussion
为了去除红细胞污染的肿瘤细胞沉淀，我们强烈建议您使用红细胞裂解液从美天旎。比传统的Ficoll密度梯度离心的红细胞裂解的优点是，它是更快，更简单。此外，利用Ficoll或红血细胞和肿瘤细胞的损失，避免污染。当你观察到的原代细胞培养成纤维细胞生长，应立即删除，因为它们通常生长肿瘤细胞时等待时间过长。
排序时细胞与美天旎MACS技术，我们建议收集细胞酶。使?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
该的作者感谢的M. Dietel教授和德克·舒马赫为支持这项工作，并批判性阅读的手稿。
导致这些结果的研究创新药物倡议联合承诺根据赠款协议Ñ°115234，资源的财政贡献，这是由欧盟第七框架计划（FP7/2007-2013）和EFPIA公司中所获得的支持实物捐助。也支持这项工作的：柏林Krebsgesellschaft（BKG）。
Materials
| Reagent | |||
| Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | |
| Amphotericin B solution 250 μg/mL in deionized water | Sigma-Aldrich, Inc. | A2942-50ml | |
| anti-fibroblasts microbeads | Miltenyi Biotec GmbH | 130-050-601 | |
| CD133/1 (W6B3C1) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-395 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich, Inc. | C5138 | |
| DNase I | Applichem GmbH | A3778.0050 | |
| D-PBS without Ca, Mg | PAA Laboratories GmbH | H15-002 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich, Inc. | E-7889 | |
| FBS Superior | Biochrom | S0615 | |
| Indirect CD133 Micro-Bead Kit human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-895 | Includes: CD133/1(AC133)-Biotin, anti-Biotin MicroBeads and FcR Blocking Reagent |
| Penicillin-Streptomycin, liquid (100x) | Invitrogen GmbH | 15140-122 | |
| Quantum 263 | PAA Laboratories GmbH | U15-815 | |
| Red Blood Cell Lysis Solution (10x) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-094-183 | |
| Equipment | |||
| Cell strainer (70 μm) | BD Biosciences | 352350 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-237 | |
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-235 | |
| MACS Separator Multi Stand | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-303 | |
| MACS Seperation Columns 25 LS Columns | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-401 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | |
| Natriumchloride | Merck KGaA | 567440-1KG | |
| Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec GmbH | 130-041-407 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-976 | |
| Rotilabo-syringe filters (0.22 μm, PES) | Carl Roth GmbH & Co. KG | P668.1 | |
| Steritop-GP Filter Unit 500 ml | Miltenyi Biotec GmbH | SCGPS05RE |
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