הכנת כרומוזום מתאים בתרבית
Summary
יכולים להיות מבודדים הכרומוזומים מתאי חיים כגון לימפוציטים או fibroblasts עור, ומאורגניזמים כולל בני אדם או עכברים. הכנות כרומוזום אלה יכולים להיות מנוצלים נוספים עבור ה-G-פסים שיגרתי ונהלים ציטוגנטית מולקולריים כגון הקרינה הכלאה באתרו (FISH), הכלאה השוואתית גנומית (CGH), וkaryotyping ספקטרלי (SKY).
Abstract
ניתוח כרומוזום (ציטוגנטית) נמצא בשימוש נרחב לגילוי של חוסר יציבות כרומוזום. כאשר אחריו ה-G-פסים וטכניקות מולקולריות כגון הקרינה הכלאה באתרו (FISH), יש assay זה את היכולת רבת עוצמה לניתוח תאים בודדים לסטיות שכוללות רווחים או הפסדים מחלקים של הגנום ושחלופים מעורבים כרומוזומים אחד או יותר. בבני אדם, מומים כרומוזום מתרחשים בכ 1 לכל 160 לידה חי 1,2, 60-80% מכלל הפלות 3,4, 10% מלידה מתות 2,5, 13% מאנשים עם מחלת לב מולדת 6, 3-6% מהמקרים בעיות פוריות 2, ואצל חולים רבים עם עיכוב התפתחותי ומומים מולדים 7. ניתוח ציטוגנטית של ממאירות משמש באופן שגרתי על ידי חוקרים וקלינאים, כמו תצפיות של פגמים בכרומוזומים משובטים הוכחו יש גם משמעות דיאגנוסטית ופרוגנוסטית 8,9.60; בידוד כרומוזום לא יסולא בפז עבור ריפוי גנטי ומחקר בתאי גזע של יצורים כוללים פרימטים ומכרסמים 10-13 לא אנושיים.
יכולים להיות מבודדים הכרומוזומים מהתאים של רקמות חיות, ובכלל זה לימפוציטים בדם, fibroblasts עור, amniocytes, שליה, מח עצם, ודגימות גידול. כרומוזומים מנותחים בשלב metaphase של מיטוזה, כאשר הם מרוכזים ביותר, ולכן בצורה ברורה יותר לעין. הצעד הראשון של טכניקת בידוד כרומוזום כרוך השיבוש של סיבי הכישור ידי דגירה עם Colcemid, כדי למנוע את התאים מפני שתמשיך לשלב anaphase שלאחר מכן. לאחר מכן טופלו התאים עם פתרון hypotonic והשתמרו במצב הנפוח שלהם עם המקבע של Carnoy. לאחר מכן התאים נפלו על שקופיות ואז יכולים להיות מנוצל עבור מגוון רחב של נהלים. G-banding כרוך טיפול טריפסין ואחרי צביעה עם Giemsa כדי ליצור אור אופייני ופסים כהים. אותו יחסי הציבורocedure לבודד את הכרומוזומים יכול לשמש להכנת תאים להליכים כגון הקרינה הכלאה באתרו (FISH), הכלאה השוואתית גנומית (CGH), וkaryotyping ספקטרלי (SKY) 14,15.
Introduction
ניתוח כרומוזום הוא טכניקה קונבנציונלית מנוצל ברחבי העולם כדי לאבחן חוסר יציבות כרומוזום ושחלופים שמובילות להפרעות גנטיות ו1,2,8,9 ממאירות. בנוסף, ברזולוציה גבוהה יותר לאבחון והמחקר של מומים גנטיים חוקתיים והסרטן רכשה ניתן להשיג עם השילוב של הנהלים הקלאסיים ציטוגנטית ומתודולוגיות ציטוגנטית מולקולריות כגון הקרינה הכלאה באתרו (FISH), הכלאה גנומית השוואתית (CGH) , וkaryotyping ספקטרלי (SKY) 14,15. לאחרונה, טכניקות אלה כבר נוצלו להערכה של חוסר יציבות כרומוזום קשור עם מחקר בתאי גזע. מומים Karyotypic כגון aneuploidy של תאים לטווח ארוך בתרבית עוברית (ES) ותאי גזע בוגרים של אורגניזמים שונים שדווחו על ידי מעבדות מרובות. הראיות אחרונות תומכת שבכמה שורות תאי מטבעם נוטים יותר instabi כרומוזוםlity ללא קשר לתנאי תרבות. מסיבה זו, בעת הקמת ו / או שמירה על אדם, עכבר, או שורות תאי גזע רזוס, ניתוח כרומוזום מומלץ כחלק מתהליך בקרת איכות. דיווחים רבים לתאר את העניין הגובר בשימוש בציטוגנטיקה השגרתית והמולקולרית כדי לפקח על היציבות בכרומוזומים של תאי גזע ותאים ממאירים או אורגניזמים שונים בתרבות 10-13. פרוטוקולים אלה הם יותר ויותר בשימוש על ידי מעבדות לא גנטיות להערכה כרומוזומלית מהירה של התאים בתרבית שלהם 13. אנו מציגים הנהלים הבסיסיים שלנו להכנת כרומוזום מסוגי תאים שונים, אשר יכול להיות מיושמים למטרות מחקריות וקליניות ובתאים שמקורם אורגניזמים שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
יש לנו מנוצלים בהליך הנוכחי לבידוד כרומוזום מהתאים של אורגניזמים שונים, לרבות סוגים שונים של תאים המתקבלים מאדם, קופי רזוס, חולדות, עכברים ו11,20-22. הפרוטוקול הסטנדרטי מסופק, אבל צעדי מפתח מסוימים ומשתנים ייתכן שיצטרכו להיות מותאמים לסוגים השונים של תאים אלה. כמה …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה המתוארת בכתב היד הזה התאפשרה על ידי מימון מקרן פטריק פ טיילור.
Materials
| KaryoMAX Colcemid | Gibco | 15212-012 | |
| HBSS Buffer | Gibco | 24020-117 | |
| 0.5% Trypsin EDTA 10x | Gibco | 15400-054 | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Buffer Tablets "GURR" | Gibco | 10580-013 | |
| Geimsa Stain | Ricca Chemical Company | 3250-16 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | ||
| Methanol | Caledon Laboratory Chemicals | 6700130 | |
| Glacial Acetic Acid | Krackeler Scientific Inc. | 11-9508-05 |
References
- Driscoll, D., Gross, S. Prenatal screening for aneuploidy. New Engl. J. Med. 360, 2556-2562 (2009).
- Nussbuam, R., et al. . Genetics in Medicine: 7th Edition. , 76 (2007).
- Ljunger, E., et al. Chromosomal abnormalities in first-trimester miscarriages. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 84 (11), 1103-1107 (2005).
- Kwinecka-Dmitri, B., et al. Frequency of chromosomal aberrations in material from abortions. Ginecol. Pol. 81 (12), 896-901 (2010).
- Reddy, U., et al. Stillbirth classification—Developing an international consensus for research: Executive summary of a national institute of child health and human development workshop. Obstet. Gynecol. 114 (4), 901-914 (2009).
- Pierpoint, M., et al. Genetic basis for congenital heart defects: Current knowledge. Circulation. 115 (23), 3015 (2007).
- Kaneshiro, N., Zieve, D. Down Syndrome: Trisomy 21.. PubMed Health. , (2010).
- Cin, P. D. . Current Protocols in Human Genetics. , (2003).
- Wang, N. Methodologies in cancer cytogenetics and molecular cytogenetics. Am. J. Med. Genet. 115 (3), 118-124 (2002).
- Miura, M., et al. Accumulated Chromosomal Instability in Murine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Leads to Malignant Transformation. Stem Cells. 24 (4), 1095-1103 (2006).
- Izadpanah, R., et al. Long-term In vitro Expansion Alters the Biology of Adult Mesenchymal Stem Cells. Cancer Res. 68 (11), 4229-4238 (2008).
- Dekel-Naftali, M., et al. Screening of human pluripotent stem cells using CGH and FISH reveals low-grade mosaic aneuploidy and a recurrent amplification of chromosome 1q. Eur. J. Hum. Genet. 20 (12), 1248-1255 (2012).
- Moralli, D., Yusuf, M., Mandegar, M., Khoja, S., Monaco, Z. L., Volpi, E. An Improved Technique for Chromosomal Analysis of Human ES and iPS Cells. Stem Cell Rev. Rep. 7 (2), 471-477 (2011).
- Bayani, J., Squire, J. Traditional banding of chromosomes for cytogenetic analysis. Curr. Protoc. Cell Biol. 22, (2004).
- Speicher, M. R., Carter, N. P. The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology. Nat. Rev. Genet. 6 (10), 782-792 (2005).
- Benn, P., Delach, J. Human Lymphocyte Culture and Chromosome Analysis. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Muul, L. M., Heine, G., Silvin, C., James, S. P., Candotti, F., Radbruch, A., Worm, M. . Measurement of Proliferative Responses of Cultured Lymphocytes, Curr. Protoc. Immunol. , (2011).
- Barch, M. J., Knutsen, T., Spurbeck, J. . The Association of Genetic Technologists Cytogenetics Laboratory Manual. San Francisco: 3rd edition. , (1997).
- Dewald, G. W., Ketterling, R. P., Wyatt, W. A., Stupca, P. J., McClatchey, K. D. Cytogenetic studies in neoplastic hematologic disorders. In Clinical Laboratory Medicine, 2nd edition. , 658-685 (2002).
- Kibe, R., et al. IL-7Rα deficiency in p53(null) mice exacerbates thymocyte telomere erosion and lymphomagenesis. Cell Death Different. 19 (7), 1139-1151 (2012).
- Tsien, F., Morava, E., Talarski, A., Marble, M. Phenotypic features of a boy with trisomy of 16q22–>qter due to paternal Y; 16 translocation. Clin. Dysmorphol. 4 (4), 177-181 (2005).
- Tsien, F., et al. Prolonged culture of normal chorionic villus cells yields ICF syndrome-like chromatin decondensation and rearrangements. Cytogenet. Genome Res. 8 (1), 13-21 (2002).
- McGrattan, P., Campbell, S., Cuthbert, R., Jones, F., McMullin, M., Humphreys, M. Integration of conventional cytogenetics (G-banding), comparative genomic hybridization (CGH) and interphase fluorescence in situ hybridization (i-FISH) for the detection of genomic rearrangements in acute leukemia. J. Clin. Pathol. 61 (8), 903-908 (2008).
