Cromosoma Preparazione da cellule in coltura

Summary

I cromosomi possono essere isolate da cellule vive come linfociti o fibroblasti cutanei, e da organismi compresi gli esseri umani o topi. Queste preparazioni cromosomiche possono essere ulteriormente utilizzati per routine di G-banding e le procedure di citogenetica molecolare quali la ibridazione in situ fluorescente (FISH), ibridazione genomica comparativa (CGH), e cariotipo spettrale (SKY).

Abstract

Cromosoma (citogenetica) analisi è ampiamente utilizzato per il rilevamento di instabilità cromosomica. Quando seguito da G-banding e le tecniche molecolari come ibridazione in situ fluorescente (FISH), questa analisi ha la potente capacità di analizzare le singole celle per le aberrazioni che coinvolgono gli utili o le perdite di porzioni del genoma e riarrangiamenti che coinvolgono uno o più cromosomi. Negli esseri umani, anomalie cromosomiche si verificano in circa 1 ogni 160 nati vivi ^1,2, il 60-80% di tutti gli aborti spontanei ^3,4, il 10% dei nati morti ^2,5, il 13% degli individui con malattia cardiaca congenita ^6, 3-6% dei casi di infertilità ^2, e in molti pazienti con ritardo dello sviluppo e difetti di nascita ^7. Analisi citogenetica di malignità è abitualmente utilizzato dai ricercatori e clinici, come osservazioni di anomalie cromosomiche clonali hanno dimostrato di avere sia un significato diagnostico e prognostico ^8,9.60; isolamento Cromosoma è prezioso per la terapia genica e la ricerca sulle cellule staminali degli organismi inclusi primati non umani e roditori ^10-13.

I cromosomi possono essere isolate da cellule di tessuti vivi, compresi i linfociti del sangue, fibroblasti cutanei, amniociti, placenta, midollo osseo, e campioni tumorali. I cromosomi sono analizzati nella fase metafase della mitosi, quando sono più condensati e quindi più visibile. Il primo passo della tecnica di isolamento cromosoma comporta la rottura delle fibre del fuso mediante incubazione con Colcemid, per evitare che le cellule di procedere alla fase successiva anafase. Le cellule sono poi trattate con una soluzione ipotonica e conservati nel loro stato gonfio di fissativo di Carnoy. Le cellule vengono poi trascinati nella vetrini e possono quindi essere utilizzati per una varietà di procedure. G-banding comprende il trattamento tripsina seguita da colorazione con Giemsa per creare luce caratteristico e bande scure. Lo stesso procedure isolare cromosomi può essere utilizzato per la preparazione di cellule per procedure quali la ibridazione in situ fluorescente (FISH), ibridazione genomica comparativa (CGH), e cariotipo spettrale (SKY) ^14,15.

Introduction

Analisi cromosomica è una tecnica tradizionale utilizzata in tutto il mondo per diagnosticare instabilità cromosomica e riarrangiamenti che portano a malattie genetiche e tumori maligni ^1,2,8,9. Inoltre, una risoluzione maggiore per la diagnosi e la ricerca di anomalie genetiche e costituzionali cancro acquisita può essere realizzato con la combinazione delle procedure citogenetiche classiche e metodologie citogenetiche molecolari come ibridazione in situ fluorescente (FISH), ibridazione genomica comparativa (CGH) , e cariotipo spettrale (SKY) ^14,15. Più recentemente, queste tecniche sono state utilizzate per la valutazione di instabilità cromosomica associata ricerca sulle cellule staminali. Anomalie del cariotipo come aneuploidia di cellule in coltura a lungo termine embrionali (ES) e cellule staminali di diversi organismi sono stati riportati da diversi laboratori. Recenti evidenze sostiene che alcune linee cellulari sono intrinsecamente più inclini al cromosoma instabilità indipendentemente dalle condizioni di coltura. Per questo motivo, al momento di stabilire e / o il mantenimento di linee di cellule staminali umane Rhesus, mouse, o, analisi cromosomica è raccomandata come parte del processo di controllo di qualità. Molti rapporti descrivono il crescente interesse per l'uso di routine e citogenetica molecolare per monitorare la stabilità cromosomica di cellule staminali e cellule maligne o vari organismi in coltura ^10-13. Questi protocolli sono sempre più utilizzati dai laboratori non genetici per una rapida valutazione cromosomica delle loro cellule in coltura ^13. Presentiamo nostre procedure di base per la preparazione cromosoma da vari tipi di cellule, che possono essere applicate per entrambi gli scopi e le cellule clinici e di ricerca derivati ​​da vari organismi.

Protocol

1. Cromosoma raccolta di cellule aderenti Protocollo standard Crescere le cellule in base alle specifiche condizioni di coltura delle cellule. Quando le cellule hanno raggiunto la fase logaritmica (80% di confluenza), aggiungere 10 microlitri / ml di Colcemid al pallone di coltura cellulare. Si raccomanda un minimo di 2 x 10 6 cellule. Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% per 45 min. Usando una pipetta sterile, trasferire file multime…

Representative Results

Spread metafase alta qualità sono essenziali per l'analisi cromosomica. Un test riuscito produce cromosomi che sono ben diffuse e di adeguata morfologia cromosoma. Cromosomi Correttamente G-banda contengono la luce caratteristico e modelli di bande scure. Figura 1. Una diffusione cromosomico suc…

Discussion

Abbiamo utilizzato il presente procedimento per il cromosoma isolamento da cellule di vari organismi, tra cui vari tipi di cellule ottenute da umano, macachi Rhesus, ratti e topi ^11,20-22. Il protocollo standard è disponibile, ma alcuni passaggi chiave e variabili potrebbe essere necessario regolare per questi diversi tipi di cellule. Diversi passaggi specifici sono cruciali sia nella preparazione cromosomica e G-bande per garantire la migliore qualità dei risultati. Una delle variabili che possono influenz…

Materials

KaryoMAX Colcemid	Gibco	15212-012
HBSS Buffer	Gibco	24020-117
0.5% Trypsin EDTA 10x	Gibco	15400-054
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Buffer Tablets "GURR"	Gibco	10580-013
Geimsa Stain	Ricca Chemical Company	3250-16
Centrifuge 5810	Eppendorf
Methanol	Caledon Laboratory Chemicals	6700130
Glacial Acetic Acid	Krackeler Scientific Inc.	11-9508-05