Cromossomo Preparação a partir de células cultivadas
Summary
Os cromossomas podem ser isolados a partir de células vivas, tais como linfócitos ou fibroblastos de pele, e a partir de organismos, incluindo seres humanos ou ratinhos. Estas preparações cromossômicas pode ser ainda utilizado para a rotina de bandamento G e procedimentos de citogenética molecular, como a hibridização fluorescente in situ (FISH), hibridização genômica comparativa (CGH), e cariotipagem espectral (SKY).
Abstract
Análise cromossómica (citogenética) é amplamente utilizado para a detecção de instabilidade cromossoma. Quando seguido por G-faixas e técnicas moleculares como a hibridização fluorescente in situ (FISH), este ensaio tem a poderosa capacidade de analisar células individuais para as aberrações que envolvem ganhos ou perdas de partes do genoma e rearranjos envolvendo um ou mais cromossomos. Nos seres humanos, anormalidades cromossômicas ocorrem em cerca de 1 a cada 160 nascidos vivos 1,2, 60-80% de todos os abortos espontâneos 3,4, 10% dos natimortos 2,5, 13% dos indivíduos com doença cardíaca congênita 6, 3-6% dos casos de infertilidade 2, e em muitos pacientes com atraso no desenvolvimento e defeitos de nascimento 7. A análise citogenética de malignidade é rotineiramente utilizado por pesquisadores e clínicos, como observações de anormalidades cromossômicas clonais foram mostrados para ter tanto significado diagnóstico e prognóstico 8,9.60; isolamento cromossomo é de valor inestimável para a terapia gênica e células-tronco de organismos, incluindo primatas não-humanos e roedores 10-13.
Os cromossomas podem ser isolados a partir de células de tecidos vivos, incluindo os linfócitos, fibroblastos da pele, amniócitos, placenta, da medula óssea e espécimes de tumor. Os cromossomas são analisados na fase metafase da mitose, quando elas são mais condensada e, por conseguinte, mais claramente visíveis. O primeiro passo da técnica de isolamento cromossoma envolve o rompimento das fibras do fuso por incubação com Colcemida, para evitar que as células de prosseguir para a fase subsequente anafase. As células são, então, tratada com uma solução hipotónica e conservados no seu estado inchado com fixador de Carnoy. As células são, então, deixada cair sobre as lâminas e pode então ser utilizado para uma variedade de procedimentos. G-bandas envolve o tratamento de tripsina seguida de coloração com Giemsa para criar luz característica e faixas escuras. O mesmo procedure para isolar os cromossomas podem ser utilizados para a preparação de células para os procedimentos, tais como hibridação in situ fluorescente (FISH), a hibridação genómica comparativa (CGH) e cariotipagem espectral (CÉU) 14,15.
Introduction
Análise cromossômica é uma técnica convencional utilizada em todo o mundo para diagnosticar instabilidade cromossômica e rearranjos que levam a desordens genéticas e malignidade 1,2,8,9. Além disso, uma maior resolução para o diagnóstico e pesquisa de anormalidades genéticas e adquiridas constitucionais-cancro pode ser conseguido com a combinação dos procedimentos citogenéticas clássicas e metodologias citogenética molecular, tais como hibridação in situ fluorescente (FISH), a hibridação genómica comparativa (CGH) e cariotipagem espectral (SKY) 14,15. Mais recentemente, estas técnicas têm sido utilizadas para a avaliação de instabilidade cromossoma associado com células estaminais. Anormalidades cariotípico tais como aneuploidia de células de longo prazo cultivadas embrionárias (ES) e células estaminais adultas de vários organismos têm sido relatados por vários laboratórios. Evidências recentes comprovam que algumas linhas de células são inerentemente mais inclinados ao cromossomo instabidade, independentemente das condições de cultivo. Por esta razão, ao estabelecer e / ou manutenção de linhas de células estaminais Rhesus humano, rato, ou, análise cromossômica é recomendado como parte do processo de controle de qualidade. Muitos relatórios descrevem o aumento do interesse na utilização de rotina e citogenética molecular para monitorar a estabilidade cromossómico de células estaminais e células malignas ou vários organismos em cultura 10-13. Estes protocolos são cada vez mais utilizados por laboratórios não genéticos para avaliação cromossômica rápida de suas células cultivadas 13. Nós apresentamos os procedimentos básicos para a preparação do cromossoma a partir de vários tipos de células, as quais podem ser aplicadas para ambos os fins e as células clínicos e de pesquisa provenientes de vários organismos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizámos o presente procedimento para o isolamento do cromossoma a partir de células de vários organismos, incluindo diferentes tipos de células obtidas a partir de humanos, macacos Rhesus, ratinhos e ratos, 11,20-22. O protocolo padrão é fornecida, mas certas etapas principais variáveis e podem ter de ser ajustados para estes diversos tipos de células. Vários passos específicos são cruciais tanto na preparação cromossômica e G-faixas para garantir a melhor qualidade possível dos result…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Trabalho descrito neste manuscrito foi possível graças ao financiamento da Fundação Patrick F. Taylor.
Materials
| KaryoMAX Colcemid | Gibco | 15212-012 | |
| HBSS Buffer | Gibco | 24020-117 | |
| 0.5% Trypsin EDTA 10x | Gibco | 15400-054 | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Buffer Tablets "GURR" | Gibco | 10580-013 | |
| Geimsa Stain | Ricca Chemical Company | 3250-16 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | ||
| Methanol | Caledon Laboratory Chemicals | 6700130 | |
| Glacial Acetic Acid | Krackeler Scientific Inc. | 11-9508-05 |
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