Den<em> Citrobacter rodentium</em> Mouse Model: Undersøgelse Patogen og Host Bidrag til infektiøs colitis
Summary
Citrobacter rodentium infektion tilvejebringer en værdifuld model til at studere enteriske bakterieinfektioner og vært immunresponser og colitis hos mus. Denne protokol beskriver målingen af barriere integritet, patogen belastning og histologisk skade giver mulighed for grundig karakterisering af patogene og vært bidrag til murine infektiøs colitis.
Abstract
Denne protokol beskriver de trin, der kræves for at producere en robust model af smitsomme sygdomme og colitis, samt de metoder, der anvendes til at karakterisere Citrobacter rodentium infektion i mus. C. rodentium er en gramnegativ, murine specifikke bakterielt patogen, der er nært beslægtet med det klinisk vigtige humane patogener enteropatogene E. coli og enterohæmoragisk E. coli. Efter infektion med C. rodentium, immunkompetente mus lider af beskeden og forbigående vægttab og diarré. Histologisk er intestinal krypt forlængelse, immun celle infiltration, og bægeret cellereduktion observeret. Clearance af infektion opnås efter 3 til 4 uger. Måling af intestinal epitelbarrieren integritet, bakteriel belastning, og histologiske skader på forskellige tidspunkter efter infektion, tillader karakteriseringen af musestammer modtagelige for infektion.
Virulens mekanismes ved hvilken bakterielle patogener koloniserer tarmkanalen hos deres værter, samt specifikke vært reaktioner, der forsvarer mod sådanne infektioner er dårligt forstået. Derfor C. rodentium model af enterisk bakteriel infektion fungerer som et værdifuldt redskab til at støtte i vores forståelse af disse processer. Enteriske bakterier er også blevet forbundet med inflammatoriske tarmsygdomme (IBDS). Det er blevet antaget, at de utilpasset kroniske inflammatoriske responser set i IBD-patienter udvikler i genetisk modtagelige individer efter unormal påvirkning af den intestinale mucosale immunsystem til enteriske bakterier. Derfor undersøgelse af modeller for infektiøs colitis har et betydeligt potentiale til at definere potentielt patogene vært reaktioner på enteriske bakterier. C. rodentium induceret colitis er en sådan sjælden model, som giver mulighed for analysen af værts-reaktioner på enteriske bakterier, fremme vores forståelse af potentielle mekanismer i IBD patogenese;afgørende for udviklingen af nye forebyggende og terapeutiske behandlinger.
Introduction
Infektion med enteriske bakterielle patogener udløser gastrointestinal (GI) inflammation, samt intestinal patologi og patofysiologi, herunder diarré og intestinale epiteliale barriere-dysfunktion. Virulensen mekanismer, hvorved bakterielle patogener koloniserer mavetarmkanalen af deres værter, samt specifikke vært reaktioner, der forsvarer mod sådanne infektioner er dårligt forstået, har dog de seneste fremskridt inden for modellering af enteriske bakterielle infektioner begyndt at hjælpe vores forståelse af disse processer. Enteriske bakterier er også blevet forbundet med inflammatoriske tarmsygdomme (IBDS). The IBDS Crohns Sygdom (CD) og UC er komplekse sygdomme af ukendt ætiologi, karakteriseret ved kronisk intestinal inflammation og vævsbeskadigelse. Mange musemodeller for tarmbetændelse findes, fra spontan inflammation i genetisk modificerede stammer, såsom IL10 – / – mus, til kemiske udfordringer med forbindelser såsom dextran natriumsulfat (DSS) og dinitrobenzene sulfonsyre (DNBS) 1. Det er blevet antaget, at de utilpasset kroniske inflammatoriske responser stede i IBD-patienter udvikler i genetisk modtagelige individer ved unormal påvirkning af den intestinale mucosale immunsystem til enteriske bakterier 2, således studiet af modeller af infektiøs colitis også betydeligt potentiale til at definere potentielt patogene host . svar på enteriske bakterier Citrobacter rodentium induceret colitis er et af de sjældne modeller af infektiøs colitis, der er blevet godt karakteriseret 1,3, hvilket muliggør analysen af værts-reaktioner på enteriske bakterier og en yderligere forståelse af potentielle mekanismer af IBD patogenese, et væsentligt trin i udvikling af nye forebyggende og terapeutiske behandlinger.
C. rodentium er en gramnegativ fastgørelse og effacing (A / E), murine specifikke bakterielt patogen, der er tæt forbundet med den vigtige humanepatogener enteropatogene E. coli (EPEC) og entero E. coli (EHEC) 3-8. Familien af A / E patogener tæt vedhæfte til den apikale værtscellemembranen af den coecale og tyktarmsepitel, danner en ikke-invasiv piedestal-lignende struktur af værtscellen. Oral smitte med C. rodentium af 10 8 -10 9 organismer frembringer en robust model for infektiøs colitis kendetegnet ved colon hyperplasi eller forlængelse af krypterne, mononukleær immune celleinfiltration og bægerceller udtømning 3,4. Det oprindelige sted for kolonisering, få timer efter belastning, er på cecal patch, efterfulgt af progression til den distale colon 2 til 3 dage efter infektion 3. Hos immunkompetente musestammer, der clearance af patogenet opnået 3 til 4 uger efter infektion 1,3,4. Imidlertid mange genetisk modificerede stammer, dvs genet deficient eller knockout (- / -) er mus, vist sig at vise increased modtagelighed for infektion resulterer i overdreven skade og / eller kronisk infektion og inflammation 9-14. Brug af denne infektiøs colitis model i disse knockout-stammer, mange mangler medfødte signalproteiner, er blevet uundværlige i afsløre flere værtsproteiner integreret til løsning af intestinal infektion og inflammation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Citrobacter rodentium infektion er en værdifuld model til undersøgelse af både smitsom sygdom og colitis hos mus. Denne unikke model giver mulighed for karakterisering af både vært reaktioner såvel som de patogene egenskaber bakterier. De skridt, der er skitseret i denne protokol detalje den vellykkede brug af denne model.
Der er flere kritiske skridt i denne protokol at huske på, når der induceres colitis og analysere svarene. For det første fremstillingen af en frisk over…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af driftstilskud til BAV fra Crohns og Colitis Foundation of Canada (CCFC) og den canadiske Institutes for Health Research (CIHR). DK blev finansieret af en afgangselev studentship fra CIHR. BAV er de Børn med tarm-og leversygdomme (CHILD) Foundation Chair of Pediatric IBD Research og Canada Research Chair i Pediatric Gastroenterology.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | ABM | G247 | Add 25 g of LB powder to 1L of water. Autoclave before using. |
| Square bottom plate with grid | Fisher | 08-757-11A | |
| Falcon culture tube | Sarstedt | 62.515.006 | |
| Bulb tipped gastric gavage needle | Fine Science Tools | 18060-20 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | FD-4 | |
| Citric acid | Sigma | C7129 | |
| Sodium citrate | Fisher | S279-500 | |
| Dextrose | Fisher | D16.1 | |
| Acid citrate dextrose | 20 mM ctiric acid, 110 mM sodium citrate, 5 mM dextrose | ||
| Black 96-well plate | Fisher | 07-200-762 | |
| Metal beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 10% formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| 5 ml vial | DiaMed | STK3205 | |
| Hematoxylin | Fisher | H345-23 | |
| Eosin | Fisher | E511-100 | |
| Xylene | Fisher | HC700-1GAL | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Coplin staining jar | VWR | 47751-792 | |
| Sodium citrate buffer | 10 mM sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0 | ||
| Pap pen | Cedarlane | Mu22 | |
| Goat serum | Sigma | G902-3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8532 | |
| Sodium azide | Sigma | SZ002 | |
| Blocking buffer | 2% goat serum, 1% BSA, 0.1% triton X-100, 0.05% Tween 20, 0.05% sodium azide, 0.01 M PBS, pH 7.2, mix & store at 4 °C. | ||
| Antibody dilution buffer | 0.1% triton X-100, 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 0.04% EDTA | ||
| Blocking buffer & Antibody dilution buffer for tir | Same recipes as above, but without addition of detergents (triton X-100 and tween 20) | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Coverslips | Fisher | 12.54SE | |
| Benchtop incubation shaker | Barnstead Lab Line | Max Q4000 | |
| Fluorometer | Perkin Elmer | Victor2D | |
| Refrigerated centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Steamer | Black & Decker | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 |
References
- Nell, S., Seurbaum, S., Josenhans, C. The impact of microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8, 564-577 (2010).
- Cario, E. Toll-like Receptors in Inflammatory Bowel Diseases: A Decade Later. Inflammatory Bowel Diseases. 16 (9), 1583-1597 (2010).
- Eckmann, L. Animal Models of Inflammatory Bowel Disease. Annals New York Academy of Sciences. , 1027-38 (2006).
- Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. Citrobacter rodentium of mice and man. Cellular Microbiology. 7, 1697-1706 (2005).
- Luperchio, S., Schauer, D. Molecular pathogenesis of Citrobacter rodentium and transmissible murine colonic hyperplasia. Microbes and Infection. 3 (4), 333-340 (2001).
- Bergstrom, K. S., Sham, H. P., Zarepour, M., Vallance, B. A. Innate host responses to enteric bacterial pathogens: a balancing act between resistance and tolerance. Cellular Microbiology. 14, 475-484 (2012).
- MacDonald, T. T., Frankel, G., Dougan, G., Goncalves, N. S., Simmons, C. Host defences to Citrobacter rodentium. International Journal of Medical Microbiology. 293, 87-93 (2003).
- Borenshtein, D., McBee, M. E., Schauer, D. B. Utility of the Citrobacter rodentium infection model in laboratory mice. Current Opinion in Gastroenterology. 24, 32-37 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Rosenberger, C. M., Bergstrom, K. S. B., Valdez, Y., Huang, J. T., Khan, M. A., Vallance, B. A. Toll-like receptor 2 plays a critical role in maintaining mucosal integrity during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10, 388-403 (2008).
- Dennis, A., Kudo, T., et al. The p50 subunit of NF-κB is critical for in vivo clearance of the non-invasive enteric pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 76 (11), 4978-4988 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Bergstrom, K. S. B., Huang, J. T., Man, C., Vallance, B. A. MyD88 signalling plays a critical role in host defence by controlling pathogen burden and promoting epithelial cell homeostasis during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10 (3), 618-631 (2008).
- Lebeis, S. L., Bommarius, B., Parkos, C. A., Sherman, M. A., Kalman, D. TLR signaling mediated by MyD88 is required for a protective innate immune response by neutrophils to Citrobacter rodentium. Journal of Immunology. 179 (1), 566-577 (2007).
- Bry, L., Brenner, M. B. Critical role of T cell dependent serum antibody, but not the gut-associated lymphoid tissue, for surviving acute mucosal infection with Citrobacter rodentium, an attaching and effacing pathogen. Journal of Immunology. 172 (1), 433-441 (2004).
- Simmons, C. P., Clare, S., et al. Central role for B lymphocytes and CD4+ T cells in immunity to infection by the attaching and effacing pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 71 (9), 5077-5086 (2003).
- Ahmed, I., Chandrakesan, P., Tawfik, O., Xia, L., Anant, S., Umar, S. Critical Roles of Notch and Wnt/β-Catenin Pathways in the Regulation of Hyperplasia and/or Colitis in Response to Bacterial Infection. Infection & Immunity. 80 (9), 3107-3121 (2012).
