La<em> Citrobacter rodentium</em> Mouse Modelo: Estudiar Contribuciones patógeno y del huésped a la colitis infecciosa
Summary
Citrobacter infección rodentium ofrece un valioso modelo para estudiar las infecciones bacterianas entéricas, así como respuestas inmunes del huésped y la colitis en ratones. Este protocolo describe la medición de la integridad de la barrera, la carga de patógenos y el daño histológico que permita la caracterización detallada de las contribuciones patógeno y del huésped a la colitis infecciosa murino.
Abstract
Este protocolo describe los pasos necesarios para producir un modelo robusto de enfermedades infecciosas y colitis, así como los métodos usados para caracterizar la infección por Citrobacter rodentium en ratones. C. rodentium es un gram negativo, murino patógeno específico bacteriana que está estrechamente relacionado con la importancia clínica humana enteropatógena patógenos E. coli y E. enterohemorrágica coli. Tras la infección con C. ratones inmunocompetentes rodentium, sufren de pérdida de peso moderada y transitoria y diarrea. Histológicamente, el alargamiento de cripta intestinal, infiltración de células inmunes, y la depleción de células caliciformes se observó. Aclaramiento de la infección se logra después de 3 a 4 semanas. La medición de la integridad de la barrera epitelial intestinal, la carga bacteriana, y daño histológico en diferentes puntos temporales después de la infección, permiten la caracterización de cepas de ratón sensibles a la infección.
El mecanismo de virulencias por el cual las bacterias patógenas colonizan el tracto intestinal de los anfitriones, así como las respuestas específicas de acogida de defensa contra estas infecciones son poco conocidos. Por lo tanto el C. rodentium modelo de infección bacteriana entérica sirve como una herramienta valiosa para ayudar en la comprensión de estos procesos. Bacterias entéricas también se han vinculado a las enfermedades inflamatorias intestinales (EII). Se ha planteado la hipótesis de que las respuestas inflamatorias crónicas inadaptadas observados en los pacientes con EII se desarrollan en individuos genéticamente susceptibles tras la exposición anormal del sistema inmune de la mucosa intestinal de bacterias entéricas. Por lo tanto, el estudio de los modelos de colitis infecciosa ofrece un potencial significativo para la definición de las respuestas potencialmente patógenas de acogida a bacterias entéricas. C. rodentium colitis inducida es un modelo poco común que permite el análisis de las respuestas del huésped a las bacterias entéricas, ampliar nuestro conocimiento de los posibles mecanismos de la patogénesis de la EII;esencial en el desarrollo de nuevos tratamientos preventivos y terapéuticos.
Introduction
La infección por patógenos bacterianos entéricos desencadena gastrointestinal (GI) la inflamación, así como patología intestinal y la fisiopatología, incluyendo la diarrea y la disfunción intestinal barrera epitelial. Los mecanismos de virulencia de patógenos bacterianos que colonizan el tracto gastrointestinal de sus anfitriones, así como las respuestas específicas de acogida de defensa contra estas infecciones son poco conocidos, sin embargo, los avances recientes en la modelización de las infecciones bacterianas entéricas han comenzado a ayudar a nuestra comprensión de estos procesos. Bacterias entéricas también se han vinculado a las enfermedades inflamatorias intestinales (EII). Enfermedad de Crohn La EII (CD) y UC son enfermedades complejas de etiología desconocida, caracterizada por la inflamación crónica intestinal y daño tisular. Muchos modelos de ratón de inflamación intestinal existen, de la inflamación espontánea en cepas genéticamente modificados, tales como IL10 – / – ratones, a los desafíos químicas con compuestos, tales como sulfato de dextrano sódico (DSS) y dinitrobenzene sulfónico (DNBS) 1. Se ha hipotetizado que las inadaptadas respuestas crónicas inflamatorias presentes en los pacientes con EII se desarrollan en individuos genéticamente susceptibles tras la exposición anormal del sistema inmune de la mucosa intestinal de bacterias entéricas 2, por lo tanto, el estudio de los modelos de colitis infecciosa también ofrece un potencial significativo para definir potencialmente patógena anfitrión . respuestas a bacterias entéricas Citrobacter rodentium colitis inducida es uno de los modelos raros de colitis infecciosa que ha sido bien caracterizado 1,3, lo que permite el análisis de las respuestas del huésped a las bacterias entéricas y una mayor comprensión de los mecanismos posibles de la patogénesis de la EII; un paso esencial en el desarrollo de nuevos tratamientos preventivos y terapéuticos.
C. rodentium es una bacteria gram negativa adhesión y borrado (A / E), murino patógeno específico bacteriana que está estrechamente relacionado con el ser humano importantepatógenos enteropatógena E. coli (EPEC) y E. enterohemorrágica coli (EHEC) 3-8. La familia de patógenos A / E íntimamente adjuntar a la membrana de la célula huésped apical del epitelio cecal y colon, la formación de un no-invasivo pedestal-como la estructura de la célula huésped. Desafío oral con C. rodentium de 10 8 -10 9 organismos produce un robusto modelo de colitis infecciosa caracterizada por hiperplasia colónica o alargamiento de las criptas, la infiltración de células mononucleares inmune y el agotamiento de las células caliciformes 3,4. El sitio inicial de colonización, unas pocas horas después de la exposición, se encuentra en el parche cecal, seguida por evolución en el colon distal 2 a 3 días después de la infección 3. En cepas de ratones inmunocompetentes, el despacho del agente patógeno se logra 3 a 4 semanas después de la infección 1,3,4. Sin embargo, muchas cepas genéticamente modificados, es decir, gen deficiente o knockout (- / -) ratones, se han encontrado para mostrar increased susceptibilidad a la infección que resulta en daño exagerada y / o infección crónica y la inflamación 9-14. El uso de este modelo de colitis infecciosa en estas cepas knockout, muchos carecen de las proteínas de señalización innatas, ha sido indispensable en la revelación de varias proteínas de acogida integral a la resolución de la infección intestinal y la inflamación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Citrobacter rodentium infección proporciona un modelo valioso para el estudio tanto de la enfermedad infecciosa y colitis en ratones. Este modelo único permite la caracterización de las dos respuestas del huésped, así como las propiedades patógenas de bacterias. Los pasos descritos en este detalle el protocolo del uso exitoso de este modelo.
Hay varios pasos críticos en este protocolo a tener en cuenta cuando se provoque colitis y el análisis de las respuestas. En primer lug…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta labor fue apoyada por subvenciones de funcionamiento para BAV de la enfermedad de Crohn y Colitis Foundation of Canada (CCFC) y los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR). GB fue financiado por una beca de postgrado de CIHR. BAV es de Niños con Trastornos intestinales y hepáticas (CHILD) Cátedra Fundación de Investigación Pediátrica EII y la Cátedra de Investigación de Canadá en Gastroenterología Pediátrica.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | ABM | G247 | Add 25 g of LB powder to 1L of water. Autoclave before using. |
| Square bottom plate with grid | Fisher | 08-757-11A | |
| Falcon culture tube | Sarstedt | 62.515.006 | |
| Bulb tipped gastric gavage needle | Fine Science Tools | 18060-20 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | FD-4 | |
| Citric acid | Sigma | C7129 | |
| Sodium citrate | Fisher | S279-500 | |
| Dextrose | Fisher | D16.1 | |
| Acid citrate dextrose | 20 mM ctiric acid, 110 mM sodium citrate, 5 mM dextrose | ||
| Black 96-well plate | Fisher | 07-200-762 | |
| Metal beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 10% formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| 5 ml vial | DiaMed | STK3205 | |
| Hematoxylin | Fisher | H345-23 | |
| Eosin | Fisher | E511-100 | |
| Xylene | Fisher | HC700-1GAL | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Coplin staining jar | VWR | 47751-792 | |
| Sodium citrate buffer | 10 mM sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0 | ||
| Pap pen | Cedarlane | Mu22 | |
| Goat serum | Sigma | G902-3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8532 | |
| Sodium azide | Sigma | SZ002 | |
| Blocking buffer | 2% goat serum, 1% BSA, 0.1% triton X-100, 0.05% Tween 20, 0.05% sodium azide, 0.01 M PBS, pH 7.2, mix & store at 4 °C. | ||
| Antibody dilution buffer | 0.1% triton X-100, 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 0.04% EDTA | ||
| Blocking buffer & Antibody dilution buffer for tir | Same recipes as above, but without addition of detergents (triton X-100 and tween 20) | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Coverslips | Fisher | 12.54SE | |
| Benchtop incubation shaker | Barnstead Lab Line | Max Q4000 | |
| Fluorometer | Perkin Elmer | Victor2D | |
| Refrigerated centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Steamer | Black & Decker | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 |
References
- Nell, S., Seurbaum, S., Josenhans, C. The impact of microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8, 564-577 (2010).
- Cario, E. Toll-like Receptors in Inflammatory Bowel Diseases: A Decade Later. Inflammatory Bowel Diseases. 16 (9), 1583-1597 (2010).
- Eckmann, L. Animal Models of Inflammatory Bowel Disease. Annals New York Academy of Sciences. , 1027-38 (2006).
- Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. Citrobacter rodentium of mice and man. Cellular Microbiology. 7, 1697-1706 (2005).
- Luperchio, S., Schauer, D. Molecular pathogenesis of Citrobacter rodentium and transmissible murine colonic hyperplasia. Microbes and Infection. 3 (4), 333-340 (2001).
- Bergstrom, K. S., Sham, H. P., Zarepour, M., Vallance, B. A. Innate host responses to enteric bacterial pathogens: a balancing act between resistance and tolerance. Cellular Microbiology. 14, 475-484 (2012).
- MacDonald, T. T., Frankel, G., Dougan, G., Goncalves, N. S., Simmons, C. Host defences to Citrobacter rodentium. International Journal of Medical Microbiology. 293, 87-93 (2003).
- Borenshtein, D., McBee, M. E., Schauer, D. B. Utility of the Citrobacter rodentium infection model in laboratory mice. Current Opinion in Gastroenterology. 24, 32-37 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Rosenberger, C. M., Bergstrom, K. S. B., Valdez, Y., Huang, J. T., Khan, M. A., Vallance, B. A. Toll-like receptor 2 plays a critical role in maintaining mucosal integrity during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10, 388-403 (2008).
- Dennis, A., Kudo, T., et al. The p50 subunit of NF-κB is critical for in vivo clearance of the non-invasive enteric pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 76 (11), 4978-4988 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Bergstrom, K. S. B., Huang, J. T., Man, C., Vallance, B. A. MyD88 signalling plays a critical role in host defence by controlling pathogen burden and promoting epithelial cell homeostasis during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10 (3), 618-631 (2008).
- Lebeis, S. L., Bommarius, B., Parkos, C. A., Sherman, M. A., Kalman, D. TLR signaling mediated by MyD88 is required for a protective innate immune response by neutrophils to Citrobacter rodentium. Journal of Immunology. 179 (1), 566-577 (2007).
- Bry, L., Brenner, M. B. Critical role of T cell dependent serum antibody, but not the gut-associated lymphoid tissue, for surviving acute mucosal infection with Citrobacter rodentium, an attaching and effacing pathogen. Journal of Immunology. 172 (1), 433-441 (2004).
- Simmons, C. P., Clare, S., et al. Central role for B lymphocytes and CD4+ T cells in immunity to infection by the attaching and effacing pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 71 (9), 5077-5086 (2003).
- Ahmed, I., Chandrakesan, P., Tawfik, O., Xia, L., Anant, S., Umar, S. Critical Roles of Notch and Wnt/β-Catenin Pathways in the Regulation of Hyperplasia and/or Colitis in Response to Bacterial Infection. Infection & Immunity. 80 (9), 3107-3121 (2012).
