Mikrofluidik-basierten electrotaxis für On-Demand-Quantitative Analyse von<em> Caenorhabditis elegans</em> 'Locomotion
Summary
Eine halbautomatische mikroelektromechanischen fluidischen Verfahren zur On-Demand-Fortbewegung in induzieren<em> Caenorhabditis elegans</em> Beschrieben. Diese Methode basiert auf dem Phänomen der neurophysiologischen Reaktion auf Würmer milden elektrischen Feldern ("electrotaxis") in mikrofluidischen Kanälen basiert. Microfluidic electrotaxis dient als schnelle, empfindliche, kostengünstige und skalierbare Technik zum Screening auf Faktoren, die neuronalen Gesundheit.
Abstract
Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans ist ein vielseitiges Modell für biomedizinische Forschung wegen seiner Erhaltung der krankheitsbedingten Gene und Signalwege sowie seiner einfachen Anbau. Mehrere C. elegans Erkrankungsmodellen berichtet worden, wie neurodegenerative Erkrankungen wie Parkinson-Krankheit (PD), welche die Degeneration dopaminerger (DA) Neuronen 1 umfasst. Beide Transgene und neurotoxische Chemikalien verwendet worden, um DA Neurodegeneration und damit verbundene Bewegung Defekte in Würmern zu induzieren, so dass für Untersuchungen der Grundlage der Neurodegeneration und Bildschirme für neuroprotektive Gene und Verbindungen 2,3.
Screens in niederen Eukaryoten wie C. elegans stellen ein effizientes und wirtschaftliches Mittel, um Verbindungen und Gene, die neuronale Signalübertragung identifizieren. Herkömmliche Bildschirme sind in der Regel manuell durchgeführt und erzielte durch visuelle Inspektion, folglich sind sie Zeit-consuming und anfällig für menschliche Fehler. Zusätzlich sind die meisten konzentrieren sich auf zellulärer Ebene Analyse unter Ignorierung Fortbewegung, ist das ein besonders wichtiger Parameter für Bewegungsstörungen.
Wir haben einen neuen mikrofluidischen Screening-System (Abbildung 1), die quantifiziert und steuert C entwickelt elegans 'Fortbewegung mit elektrischen Feldes innerhalb Mikrokanäle Reize. Wir haben gezeigt, dass ein Gleichstrom (DC)-Feld kann robust on-demand Fortbewegung in Richtung der Kathode ("electrotaxis") 4 induzieren. Umkehrung des Feldes Polarität der Wurm schnell seine Richtung umzukehren als gut. Wir haben auch gezeigt, dass Defekte in dopaminergen und anderen sensorischen Neuronen den Swimming Antwort 5 ändern. Daher kann Anomalien in neuronalen Signalübertragung ermittelt Fortbewegung als read-out werden. Die Bewegung Antwort kann genau quantifiziert werden mit einer Reihe von Parametern wie Geschwindigkeit Schwimmen, Körper Biegeeigenfrequenz und Wendezeit.
<p class = "jove_content"> Unsere Arbeit hat gezeigt, dass die Reaktion mit electrotactic Alter variiert. Insbesondere junge Erwachsene zu einem niedrigeren Bereich von elektrischen Feldern zu reagieren und bewegen sich schneller im Vergleich zu 4 Larven. Diese Erkenntnisse führten wir eine neue Mikrofluidikvorrichtung passiv sortieren Würmer nach Alter und Phänotyp 6 entwerfen.Wir haben auch die Reaktion der Würmer gepulsten DC getestet und Wechselstrom (AC) elektrische Felder. Pulsed DC Felder der verschiedenen Arbeitszyklen effektiv erzeugt electrotaxis sowohl in C. elegans und seinen Cousin C. briggsae 7. In einem anderen Experiment immobilisiert symmetrisch Wechselfelder mit einer Frequenz von 1 Hz bis 3 KHz Würmer in den Kanal 8.
Umsetzung des elektrischen Feldes in einem mikrofluidischen Umgebung ermöglicht eine schnelle und automatisierte Ausführung des electrotaxis Assay. Dieser Ansatz verspricht hohen Durchsatz genetischen und chemischen Faktoren für Bildschirme erleichternbeeinflussen neuronale Funktion und Lebensfähigkeit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Unter Ausnutzung der Verhaltens-Phänomen erstmals von Gabel und Kollegen und Gebäude auf dem dielektrophoretischen Manipulation Arbeit von Chuang und Kollegen 11,12 beschrieben, stellt unsere Mikrofluidik-basierten electrotaxis Assay eine einfache, robuste und sensitive Methode, um neuronale Aktivität in Worms mit Bewegung als Sonde einen Ausgang. Die Analyse der Parameter der Bewegung ermöglicht quantitative Vergleich zwischen verschiedenen Genotypen. Die Präzision der Fertigung und Mikrokanalstruktur e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei den Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, Canada Research Chairs Programm, Canadian Institutes of Health Research und Ontario Ministerium für Forschung und Innovation durch ihre frühe Forscher Award Programm für die finanzielle Unterstützung bedanken.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Acetone | CALEDON Labs | 1200-1-30 | |
| Methanol | CALEDON Labs | 6700-1-30 | |
| Isopropanol | CALEDON Labs | 8600-1-40 | |
| SU-8 | Microchem Corp. | Y131273 | SU-8 100 |
| SU-8 Developer | Microchem Corp. | Y020100 | |
| 92×16 mm Petri dish | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Contains elastomer base and curing agent | |
| Function generator | Tektronix Inc. | Model AFG3022B | |
| Amplifier | Trek Inc. | Model 2210-CE | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4506 | Model 11 ELITE |
| Hot plate | Fisher Scientific | 11675916Q | Model HP131725Q |
References
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