הכנת Liposome ענקית הדמיה ותיקון מהדק Electrophysiology
Summary
בנייה מחדש של חלבונים בממברנה פונקציונליים ליפוזומים ענקים של הרכב מוגדר היא גישה רב עוצמה בשילוב עם electrophysiology תיקון מהדק. עם זאת, ייצור liposome ענק קונבנציונלי עשוי להיות בקנה אחד עם יציבות חלבון. אנו מתארים פרוטוקולים לייצור ליפוזומים ענקים משומנים טהורים או ליפוזומים קטן המכיל תעלות יונים.
Abstract
הכינון מחדש של תעלות יונים בממברנות שומנים בדם הגדרה כימית להקלטת אלקטרו כבר טכניקה רב עוצמה כדי לזהות ולחקור את תפקודם של החלבונים החשובים אלה. עם זאת, הכנות הקלסיים, כגון bilayers מישוריים, להגביל את המניפולציות וניסויים שניתן לבצע בערוץ המשוחזר וסביבת הקרום שלה. מבנה דמוי תא יותר ליפוזומים ענקים מתיר ניסויי תיקון-מהדק מסורתיים מבלי להקריב את השליטה בסביבת השומנים בדם.
Electroformation הוא ממוצע יעיל כדי לייצר ליפוזומים ענקים> 10 מיקרומטר בקוטר אשר מסתמך על היישום של מתח חילופין לסרט שומנים רזה, מסודר שהופקד על פני האלקטרודה. עם זאת, מאחר שהפרוטוקול הקלסית קורא את השומנים שיופקדו מממסים אורגניים, זה לא תואם עם חלבונים בממברנה פחות חזקים כמו תעלות יונים וחייב להיות שונה. לאחרונה, יחסי ציבורotocols פותחו כדי electroform יפוזומים ענקים מיפוזומים קטנים באופן חלקי מיובשים, שיש לנו להתאים ליפוזומים המכילים חלבון במעבדה שלנו.
אנו מציגים כאן את הרקע, ציוד, טכניקות, ואת החסרונות של electroformation של יפוזומים ענקים מתפוצות liposome קטנות. אנחנו מתחילים עם הפרוטוקול קלאסי, שאמורה להיות שולטים ראשון לפני שתנסו את הפרוטוקולים מאתגרים יותר שבאים אחרי. אנו מדגימים את התהליך של התייבשות חלקית מבוקרת של שיווי משקל ליפוזומים קטנים באמצעות אדים עם פתרונות מלח רוויים. לבסוף, אנחנו מדגימים את התהליך של electroformation עצמו. נתאר ציוד פשוט, זול, שיכול להתבצע בבית כדי לייצר ליפוזומים באיכות גבוהה, ולתאר בדיקה ויזואלית של ההכנה בכל שלב כדי להבטיח את התוצאות הטובות ביותר.
Introduction
ליפוזומים ענקים (הנקרא לעתים קרובות שלפוחית unilamellar ענקית, או GUVs) יש בעיקר נעשו שימוש כדי ללמוד את הפיזיקה וכימיה פיסיקלית של bilayers שומנים, כולל מחקרים של עיוות bilayer, דו קיום שלב לרוחב ("רפסודות"), איחוי קרום, וכו '1-4. יש להם מבנה גס דמוי תא: מעטפת כדורית של קרום המקיפה פנים מימיות אשר יכול בקלות להתבצע שונה מהמאגר הימי שמסביב. הם, בהגדרה, ≈ 1-100 מיקרומטר קוטר, כך שהם יכולים להיות צילמו באמצעות מגוון של גישות אור מיקרוסקופית. הם יכולים להתבצע באמצעות מתוחים הדרגתיים אוסמוטי או מתח מיושם באופן מכאני, כך שבדרך כלל תוך רכה, ניתן להשפיע המאפיינים שלהם לטיפול קל. בפרט, שליטה על "הקשיחות" של liposome עושה את זה פשוט כדי ליצור תיקונים "liposome-מצורפים" או נכרת לאלקטרופיזיולוגיה. בעבר, הכינון מחדש ערוץ יון בוצע בעיקר בסעיף ב 'שומנים מישורייםilayers. עכשיו, היכולת ליצור כתמים מיפוזומים ענקים ולהשתמש אשפה מבוטלת של כלים שפותחו עבור electrophysiology הקונבנציונלי (מיקרוסקופ פלואורסצנטי, שאיפת micropipette, זלוף המהיר ובקרת טמפרטורה, וכו ') גורמת ליפוזומים ענקים אטרקטיבית יותר ויותר עבור לימודי כינון מחדש 5,6.
ליפוזומים ענקים שנעשו על ידי אסטרטגיות רבות. למעשה, ליפוזומים ענקים בצורה ספונטנית על ידי תהליך נפיחות כאשר סרט שומנים בדם מיובש הוא rehydrated 4,7,8. התשוקה במהירות רבה יותר כדי להכין גדולים יותר, אחידים יותר ליפוזומים הביאו את החוקרים לגישות אחרות, ובראשם electroformation 1,9. Electroformation גם מסתמך על הידרציה של סרט שומנים בדם מיובש, אבל מאיץ את התהליך באמצעות היישום של שדה חשמלי על פני נדנוד סרט השומנים בדם. תחום מיושם באמצעות שתי אלקטרודות, או חוטי פלטינה או שקופיות זכוכית מצופים אינדיום בדיל תחמוצת (איטו), מופרד על ידי מים אוהמאגר ואליו השומנים מופקדים. נהיגה במהירות מופרזת על ידי הנפיחות של יפוזומים, אחד משיג תשואה גבוהה יותר של יפוזומים גדולים יותר. לפיכך, electroformation הפך שיטת ברירת המחדל כדי לייצר ליפוזומים ענקים 4.
המנגנון של electroformation לא מובן לחלוטין, ורוב הפרוטוקולים שפותחו באופן אמפירי (למשל 10,11). יחד עם זאת, אנו יכולים ללמוד קצת על מה לצפות על ידי בהתחשב בתאוריה וכמה תוצאות אמפיריות. הוא האמין נרחב כי electroformation מתרחש על ידי הנהיגה זרימת אלקטרו האוסמוטי של חיץ בין bilayers שומנים הבודדים שנערמו בסרט השומנים הופקד 10,11. צימוד אלקטרוסטטית לתנודות תרמיות של bilayers השומנים הוא כנראה מעורב גם 12. השערות אלה לחזות איכותי גבולות עליונים לתדר השדה החשמלי וכוח שניתן להשתמש בי 10,12. בפרט, הוא נבאה פתרונות מוליכות גבוהים ש( <e> פתרונות מלח פיסיולוגיים כלומר מ ') להפחית את כוחות electrohydrodynamic שעשוי ליזום electroformation liposome 12. ספיקות Electroosmotic בדרך כלל יורדות עם הגדלת ריכוז המלח והגיעו לשיאו בתדירות גבוהה בתדירות כלשהי תנודת שדה חשמלית (לדוגמה אם כי בגיאומטריה שונה, הירוק ואח'. 13). לכן, עוצמות שדה גבוהות יותר ותדרים גבוהים יותר הם סבירות לפתרונות מוליכות גבוהים, בגבולות 10.
עם זאת, חלבוני קרום עשויים להיות בקנה אחד עם שיטת הרגילה של הפקדת שומנים על גבי אלקטרודות להליך electroswelling, כלומר בממסים אורגניים אשר לאחר מכן התאדו לעזוב את סרט שומנים בדם דק. ישנם שני מסלולים עיקריים סביב קושי זה: לשלב חלבונים לאחר היווצרות liposome ענקית, או להתאים את האופן שבו השומנים מופקדים. הגישה שלנו בונה על אחרים 5,11 להפקיד את השומנים וreconstituted חלבון קרום יחד מהשעיה של "proteoliposomes" קטן או גדול. אנו מתארים את התהליך הארוך ומאתגר יותר של ייצור proteoliposomes ממטוהרי חלבון ושומנים במקומות אחרים (וקולינס גורדון, בסקירה). כאן אנו מתארים את הפרוטוקול בהיעדרו של כל חלבון, אבל זה אותו הדבר כאשר החלבון משולב; אנו כוללים תוצאות מראות כי proteoliposomes המכיל יון הערוץ TRPV1 ניתן להפוך GUVs ומשמש לתיקון מהדק electrophysiology. בכל גישת electroformation, בדיקה ויזואלית של מדגם השומנים במהלך תהליך הדחת השומנים בדם היא קריטית להצלחה.
הגישה שלנו עשויה להיות רלוונטית מעבר ליישום מיוחד לכינון מחדש תעלת יונים. בזמן מאז שפותחנו לראשונה פרוטוקול זה ועכשיו, יש לו גם הראה כיצד אופן שבו שומנים מופקדים על אלקטרודות לelectroformation משפיע ההטרוגניות ההלחנה של GUVs כתוצאה מכך. Baykאל Caglar et al. הראה כי 14 GUVs נוצר בזהירות ליפוזומים המיובשים הייתה וריאציה קטנה יותר פי 2.5 בטמפרטורת המעבר של miscibility GUVs נוצר מתערובות של פוספוליפידים וכולסטרול שונים. העבודה שלהם מצביעה על כך ששומנים וכולסטרול במיוחד נמהר, במאי מתערובת השומנים בדם, כאשר הופקדו מממסים אורגניים, וכתוצאה מהווריאציה המרחבית גדולה בהרכב של סרט השומנים שהופקד. זה חשוב במיוחד ללימודים של התנהגות שלב קרום שומנים בדם, אך הוא עשוי להיות גם קריטי לניסויים כמותיים על תפקוד תעלת יונים. Baykal-Caglar אח' 's. פרוטוקול הוא דומה אך לא זהה לזו שלנו, ואנו מעודדים את קוראים ללמוד אותו גם כן.
פרוטוקול זה (ראה סקירה, איור 1) הוא אחד מרבים שיכולים להיות בשימוש. בהצלחת electroformation עיקרון תלויה בתערובת השומנים בדם, לחות, טמפרטורה, מומסים אחרים (בעיקר יונים), ושלכמובן מתח ותדר בשימוש במבנה. כelectroformation הופך להבין טוב יותר, אנו מצפים לשפר את הפרוטוקול שלנו יותר.
לבסוף, לעתים קרובות יש עקומה למידה תלולה בelectroforming יפוזומים ענקיים. אנו ממליצים מאסטרינג פרוטוקול המקובל (סעיפים 1 ו -4, ואם יש צורך, סעיף 5) לפני שלומדים להפקיד שומנים מהשעיות liposomal (סעיפים 2-5).
Protocol
Representative Results
Discussion
Electroformation של יפוזומים ענקים התפתח טכניקה גמישה תואמת עם שומנים שונים, תכשירים, וחוצצים. שליטה מדוקדקת של התהליך בתצהיר השומנים היא קריטית ביותר להצלחה. יש לנו הצגנו כלים פשוטים כדי להפוך תצהיר מבוקר של שומנים מהכנות liposome קטנות תהליך פשוט. הלחות היחסית היא קריטית להתי?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לבריאן Venema ואריק מרטינסון לבניית מנגנון electroformation. עבודה זו מומנה על ידי מענקים מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומי לבריאות (R01GM100718 לSEG) והמכון הלאומי לעיניים של המכונים הלאומי לבריאות (R01EY017564 לSEG).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Digital Multimeter | Agilent Technologies, www.agilent.com | U1232A or similar | Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test. |
| Fluke | 117 or 177 | Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test. | |
| Function Generator | Agilent Technologies, www.agilent.com | 33210A or similar | Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load |
| ITO coated glass slides | Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com | CB-90IN-S107 or similar | Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm |
| Temperature controller | Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com | CNi3233 or similar | |
| Hygrometer | Extech, Nashua, NH, www.extech.com | 445815 | |
| Silicone rubber sheet | McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com | 87315K64 | Use USP Grade VI silicone for its high purity |
| EMI gasket | Laird Technologies www.lairdtech.com | 4202-PA-51H-01800 or similar | Distributed by Mouser www.mouser.com |
| TxR-DHPE | Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com | T1395MP | Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable. |
| POPC | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com | 850457P or 850457C | Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C) |
| POPS | Avanti Polar Lipids | 840034P/C | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |
References
- Dimova, R., Aranda, S., Bezlyepkina, N., Nikolov, V., Riske, K. A., Lipowsky, R. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. Journal of Physics-Condensed Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).
- Luisi, P. L., Walde, P. . Giant Vesicles. , (2000).
- Riquelme, G., Lopez, E., Garcia-Segura, L. M., Ferragut, J. A., Gonzalez-Ros, J. M. Giant liposomes: a model system in which to obtain patch-clamp recordings of ionic channels. Biochimie. 29 (51), 11215-11222 (1990).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Aimon, S., Manzi, J., Schmidt, D., Poveda Larrosa, J. A., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Functional reconstitution of a voltage-gated potassium channel in giant unilamellar vesicles. PLoS. One. 6 (10), e25529 (2011).
- Girard, P., Pecreaux, J., Lenoir, G., Falson, P., Rigaud, J. L., Bassereau, P. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophys. J. 87 (1), 419-429 (2004).
- Manley, S., Gordon, V. D. Making giant unilamellar vesicles via hydration of a lipid film. Curr. Protoc. Cell. Biol. 24, 1-13 (2008).
- Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).
- Angelova, M. I., Soleau, S., Meleard, P., Faucon, J. F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Progressin Colloid & Polymer Science. 89, 127-131 (1992).
- Politano, T. J., Froude, V. E., Jing, B., Zhu, Y. AC-electric field dependent electroformation of giant lipid vesicles. Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 79 (1), 75-82 (2010).
- Pott, T., Bouvrais, H., Méléard, P. Giant unilamellar vesicle formation under physiologically relevant conditions. Chem. Phys. Lip. 154 (2), 115-119 (2008).
- Sens, P., Isambert, H. Undulation Instability of Lipid Membranes under an Electric Field. Phys. Rev. Lett. 88 (12), (2002).
- Green, N. G., Ramos, A., González, A., Morgan, H., Castellanos, A. Fluid flow induced by nonuniform ac electric fields in electrolytes on microelectrodes. I. Experimental measurements. Phys. Rev. E. 61 (4), 4011-4018 (2000).
- Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity. Biochim. Biophys. Acta. 1818 (11), 2598-2604 (2012).
- Bakalyar, S. R., Bradley, M. P. T., Honganen, R. The role of dissolved gases in high -performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 158, 277-293 (1978).
- Brown, J. N., Hewins, M., Van Der Linden, J. H. M., Lynch, R. J. Solvent degassing and other factors affecting liquid chromatographic detector stability. J. Chromatogr. A. 204, 115-122 (1981).
- Dolan, J. W. Mobile Phase Degassing-Why, When, and How. LC-GC. 17 (10), 909-912 (1999).
- Cheng, H., Jiang, X., Han, X. Alterations in lipid homeostasis of mouse dorsal root ganglia induced by apolipoprotein E deficiency: a shotgun lipidomics study. J. Neurochem. 101 (1), 57-76 (2007).
- Greenspan, L. Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions. J. Res. Natl. Bur. Stand. 81 (1), 89-96 (1977).
- Rockland, L. B. Saturated Salt Solutions for Static Control of Relative Humidity between 5 ° and 40 °C. Anal. Chem. 32 (10), 1375-1376 (1960).
- Washburn, E. W. . International Critical Tables of Numerical Data, Physics, Chemistry and Technology (1st Electronic Edition). , 216-249 (2003).
- Estes, D. J., Mayer, M. Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber. Biochim. Biophys. Acta. 1712 (2), 152-160 (2005).
- Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. Lipid Peroxides Promote Large Rafts: Effects of Excitation of Probes in Fluorescence Microscopy and Electrochemical Reactions during Vesicle Formation. Biophys. J. 91 (6), 2172-2183 (2006).
- Morales-Penningston, N. F., Wu, J., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim. Biophys. Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).
- Grit, M., de Smidt, J. H., Struijke, A., Crommelin, D. J. Hydrolysis of phosphatidylcholine in aqueous liposome dispersions. Int. J. Pharm. 50 (1), 1-6 (1989).
- Zhou, Y., Berry, C. K., Storer, P. A., Raphael, R. M. Peroxidation of polyunsaturated phosphatidyl-choline lipids during electroformation. Biomaterials. 28 (6), 1298-1306 (2007).
- Farkas, E. R., Webb, W. W. Multiphoton polarization imaging of steady-state molecular order in ternary lipid vesicles for the purpose of lipid phase assignment. J. Phys. Chem. B. 114 (47), 15512-15522 (2010).
- Hauser, H. O. The effect of ultrasonic irradiation on the chemical structure of egg lecithin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 45 (4), 1049-1055 (1971).
- Hauser, H., Cevc, G. Phospholipid vesicles. Phospholipids Handbook. , (1993).
- Veatch, S. L. Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases. Meth. Mol. Biol. 398, 59-72 (2007).
- Kim, R. S., LaBella, F. S. Comparison of analytical methods for monitoring autoxidation profiles of authentic lipids. J. Lipid. Res. 28 (9), 1110-1117 (1987).
- Veatch, S. L., Leung, S. S. W., Hancock, R. E. W., Thewalt, J. L. Fluorescent probes alter miscibility phase boundaries in ternary vesicles. J. Phys. Chem. B. 111 (3), 502-504 (2007).
- Juhasz, J., Davis, J. H., Sharom, F. J. Fluorescent probe partitioning in GUVs of binary phospholipid mixtures: implications for interpreting phase behavior. Biochim. Biophys. Acta. 1818 (1), 19-26 (2012).
- Herold, C., Chwastek, G., Schwille, P., Petrov, E. P. Efficient electroformation of supergiant unilamellar vesicles containing cationic lipids on ITO-coated electrodes. Langmuir. 28 (13), 5518-5521 (2012).
