À grande échelle non ciblée profilage métabolomique du sérum par Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Summary

Le profilage des métabolites non ciblés par chromatographie liquide ultra performante couplée à la spectrométrie de masse (UPLC-MS) est une technique puissante pour étudier le métabolisme. Cet article décrit un flux de travail typique utilisé pour le profilage non ciblé des métabolites du sérum, y compris l’organisation et la préparation des échantillons, l’acquisition de données, l’analyse des données, le contrôle de la qualité et l’identification des métabolites.

Abstract

Le profilage des métabolites non ciblés par chromatographie liquide ultra performante couplée à la spectrométrie de masse (UPLC-MS) est une technique puissante pour étudier le métabolisme. L’approche offre une analyse impartiale et approfondie qui peut permettre le développement de tests de diagnostic, de nouvelles thérapies et d’approfondir notre compréhension des processus pathologiques. La diversité chimique inhérente au métabolome crée d’importants défis analytiques et il n’existe pas d’approche expérimentale unique capable de détecter tous les métabolites. De plus, la variation biologique du métabolisme individuel et la dépendance du métabolisme vis-à-vis des facteurs environnementaux nécessitent un grand nombre d’échantillons pour atteindre la puissance statistique appropriée requise pour une interprétation biologique significative. Pour relever ces défis, ce tutoriel décrit un flux de travail analytique pour le profilage non ciblé des métabolites sériques à grande échelle par UPLC-MS. La procédure comprend des lignes directrices pour l’organisation et la préparation des échantillons, l’acquisition de données, le contrôle de la qualité et l’identification des métabolites et permettra une acquisition fiable de données pour de grandes expériences et fournira un point de départ pour les laboratoires novices en matière de profilage non ciblé des métabolites par UPLC-MS.

Introduction

Le terme « métabolomique » peut englober beaucoup de choses. Par exemple, une expérience métabolomique peut être réalisée à l’aide de diverses plateformes analytiques telles que la RMN et la chromatographie en phase gazeuse et/ou liquide couplée à la spectrométrie de masse. De plus, les expériences métabolomiques peuvent être réalisées de manière ciblée ou non ciblée, ou une combinaison des deux. Une expérience métabolomique ciblée impliquera l’analyse dirigée d’un panel de molécules importantes pour la question biologique à l’étude (par exemple, de petites molécules impliquées dans le cycle du TCA permettront une quantification précise de cette voie). Da....

Protocol

1. Exemple d’organisation

1. Pour créer une carte de plaque pour la préparation d’échantillons sur une feuille de calcul, entrez dans la première colonne une liste d’échantillons par ordre de chargement. Dans une deuxième colonne, entrez les 96 emplacements des plaques de puits en utilisant la nomenclature correcte pour votre logiciel d’échantillonneur automatique.
2. Conservez un puits dans chaque plaque pour les échantillons de contrôle qualité.
3. Si votre passeur d’échantillons LC peut traiter deux plaques à la fois, séparez la liste d’échantillons en lots de 190 et enregistrez ces informations dans une deuxième feuille de travail.

Results

Les étapes analytiques de base d’une expérience de profilage de métabolites non ciblés par UPLC-MS sont décrites dans la figure 1. Les données brutes de chaque échantillon peuvent être visualisées sous la forme d’un chromatogramme à pic de base. La figure 2 montre un exemple de chromatogramme de pointe de base d’un échantillon de sérum analysé par l’option de gradient (a) dans le tutoriel. À la suite de l’analyse statistique décrite ci-dessus, l’identification des métabolites est tent.......

Discussion

Ce tutoriel est destiné à servir de point de départ pour la réalisation d’un profilage de métabolites non ciblé à grande échelle par UPLC-MS. Le flux de travail se concentre sur les métabolites qui peuvent être extraits avec un solvant aqueux de méthanol, retenus sur une colonne UPLC C8 ou C18 et détectés sous forme d’ions positifs. Dans le cas où il n’y a pas de biais prédéterminé en faveur d’une classe de métabolites spécifique et qu’une hypothèse générant un profil global est souhaitée, ce protocole est précieux car i.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 plaques de puits - 500 &mu ; l puits VWR		40002-020	Ceux-ci sont utilisés pour la préparation d’échantillons
96 tapis de plaques	de puits VWR	89026-514 Ceux-ci	sont utilisés pour la préparation d’échantillons
96 plaques de puits - 350 &mu ; l puits Waters	Corporation	WAT058943	Ceux-ci sont utilisés pour l’injection d’échantillons
96 tapis de plaques de puits	Waters Corporation	186000857	Ceux-ci sont utilisés pour l’injection d’échantillons
96 scellages thermiques de plaques de puits	Waters Corporation	186002789	Ceux-ci peuvent être utilisés pour l’injection d’échantillons ou le stockage à long terme
96 scelleuse thermique de plaques de puits	Waters Corporation	186002786
Méthanol de qualité LC-MS	Fluka	34966
Acétonitrile de qualité LC-MS	Fluka	34967
formique de qualité LC-MS	Fluka	56302
Pipette électronique multicanaux	VWR	89000-674
Pointes Pipett	Eclipse (achetée via Light Labs)	B-5061/B-4061
Centrifugeuse réfrigérée - Allegra X-12R	Beckman Coulter	N/A - contact Beckman Coulter
Acquity Ultra performance Chromatographie liquide (UPLC) System	Waters Corporation	N/A - contact Waters Corporation
UPLC C8 colonne (option de dégradé a)	Waters Corporation	186002876
Colonne UplC T3 (option de gradient b)	Waters Corporation	186003536
Xevo G2 Q-TOF	Spectromètre de masse Waters Corporation	N/A - contacter Waters Corporation