Le profilage des métabolites non ciblés par chromatographie liquide ultra performante couplée à la spectrométrie de masse (UPLC-MS) est une technique puissante pour étudier le métabolisme. Cet article décrit un flux de travail typique utilisé pour le profilage non ciblé des métabolites du sérum, y compris l’organisation et la préparation des échantillons, l’acquisition de données, l’analyse des données, le contrôle de la qualité et l’identification des métabolites.
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Article de méthode
À grande échelle non ciblée profilage métabolomique du sérum par Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le profilage des métabolites non ciblés par chromatographie liquide ultra performante couplée à la spectrométrie de masse (UPLC-MS) est une technique puissante pour étudier le métabolisme. L’approche offre une analyse impartiale et approfondie qui peut permettre le développement de tests de diagnostic, de nouvelles thérapies et d’approfondir notre compréhension des processus pathologiques. La diversité chimique inhérente au métabolome crée d’importants défis analytiques et il n’existe pas d’approche expérimentale unique capable de détecter tous les métabolites. De plus, la variation biologique du métabolisme individuel et la dépendance du métabolisme vis-à-vis des facteurs environnementaux nécessitent un grand nombre d’échantillons pour atteindre la puissance statistique appropriée requise pour une interprétation biologique significative. Pour relever ces défis, ce tutoriel décrit un flux de travail analytique pour le profilage non ciblé des métabolites sériques à grande échelle par UPLC-MS. La procédure comprend des lignes directrices pour l’organisation et la préparation des échantillons, l’acquisition de données, le contrôle de la qualité et l’identification des métabolites et permettra une acquisition fiable de données pour de grandes expériences et fournira un point de départ pour les laboratoires novices en matière de profilage non ciblé des métabolites par UPLC-MS.
Introduction
Le terme « métabolomique » peut englober beaucoup de choses. Par exemple, une expérience métabolomique peut être réalisée à l’aide de diverses plateformes analytiques telles que la RMN et la chromatographie en phase gazeuse et/ou liquide couplée à la spectrométrie de masse. De plus, les expériences métabolomiques peuvent être réalisées de manière ciblée ou non ciblée, ou une combinaison des deux. Une expérience métabolomique ciblée impliquera l’analyse dirigée d’un panel de molécules importantes pour la question biologique à l’étude (par exemple, de petites molécules impliquées dans le cycle du TCA permettront une quantification précise de cette voie). Da....
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Protocole
1. Exemple d’organisation
- Pour créer une carte de plaque pour la préparation d’échantillons sur une feuille de calcul, entrez dans la première colonne une liste d’échantillons par ordre de chargement. Dans une deuxième colonne, entrez les 96 emplacements des plaques de puits en utilisant la nomenclature correcte pour votre logiciel d’échantillonneur automatique.
- Conservez un puits dans chaque plaque pour les échantillons de contrôle qualité.
- Si votre passeur d’échantillons LC peut traiter deux plaques à la fois, séparez la liste d’échantillons en lots de 190 et enregistrez ces informations dans une deuxième feuille de travail.
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Résultats
Les étapes analytiques de base d'une expérience de profilage métabolomique non ciblé par UPLC-MS sont décrites dans la Figure 1. Les données brutes de chaque échantillon peuvent être visualisées sous forme de chromatogramme de pics de base. La Figure 2 présente un exemple de chromatogramme de pics de base d'un échantillon de sérum analysé selon l'option de gradient (a) du didacticiel. Après l'analyse statistique décrite ci-dessus, une identification des métabolites est tentée pour toutes.......
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Discussion
Ce tutoriel est destiné à servir de point de départ pour la réalisation d’un profilage de métabolites non ciblé à grande échelle par UPLC-MS. Le flux de travail se concentre sur les métabolites qui peuvent être extraits avec un solvant aqueux de méthanol, retenus sur une colonne UPLC C8 ou C18 et détectés sous forme d’ions positifs. Dans le cas où il n’y a pas de biais prédéterminé en faveur d’une classe de métabolites spécifique et qu’une hypothèse générant un profil global est souhaitée, ce protocole est précieux car i.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Le tutoriel présenté a été réalisé et développé au sein de l’installation de protéomique et de métabolomique de l’Université d’État du Colorado, qui est partiellement financée par les ressources d’administration de la recherche CSU pour les projets universitaires.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 96 plaques de puits - 500 &mu ; l puits VWR | 40002-020 | Ceux-ci sont utilisés pour la préparation d’échantillons | |
| 96 tapis de plaques | de puits VWR | 89026-514 Ceux-ci | sont utilisés pour la préparation d’échantillons |
| 96 plaques de puits - 350 &mu ; l puits Waters | Corporation | WAT058943 | Ceux-ci sont utilisés pour l’injection d’échantillons |
| 96 tapis de plaques de puits | Waters Corporation | 186000857 | Ceux-ci sont utilisés pour l’injection d’échantillons |
| 96 scellages thermiques de plaques de puits | Waters Corporation | 186002789 | Ceux-ci peuvent être utilisés pour l’injection d’échantillons ou le stockage à long terme |
| 96 scelleuse thermique de plaques de puits | Waters Corporation | 186002786 | |
| Méthanol de qualité LC-MS | Fluka | 34966 | |
| Acétonitrile de qualité LC-MS | Fluka | 34967 | |
| formique de qualité LC-MS | Fluka | 56302 | |
| Pipette électronique multicanaux | VWR | 89000-674 | |
| Pointes Pipett | Eclipse (achetée via Light Labs) | B-5061/B-4061 | |
| Centrifugeuse réfrigérée - Allegra X-12R | Beckman Coulter | N/A - contact Beckman Coulter | |
| Acquity Ultra performance Chromatographie liquide (UPLC) System | Waters Corporation | N/A - contact Waters Corporation | |
| UPLC C8 colonne (option de dégradé a) | Waters Corporation | 186002876 | |
| Colonne UplC T3 (option de gradient b) | Waters Corporation | 186003536 | |
| Xevo G2 Q-TOF | Spectromètre de masse Waters Corporation | N/A - contacter Waters Corporation |
Références
- Theodoridis, G., Gika, H. G., Wilson, I. D. Mass Spectrometry-Based Holistic Analytical Approaches for Metabolite Profiling in Systems Biology Studies. Mass Spectrom. Rev. 30, 884-906 (2011).
- Zelena, E., et al.
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Réimpressions et autorisations
