液泡和胞质pH值的测量<em>在体内</em在酵母细胞悬浮液
Summary
可以测量活酵母液泡膜和细胞内pH值（<em> S。酵母</em>）定位到特定的细胞区室的使用比例荧光染料的细胞。我们描述BCECF-AM，定位于液泡酵母，细胞内pH值与胞浆的比例的pH敏感GFP（酵母pHluorin所指示）测量空泡pH值的程序。
Abstract
在酵母细胞中液泡和胞质pH值受到高度监管和整体pH值稳态占据了核心作用。我们描述了协议的比例测量pH值在体内使用pH敏感的荧光团本地化液泡或细胞质。 BCECF，乙酰甲酯形式导入细胞时，它定位在酵母液泡液泡pH值是衡量使用。细胞质pH值的测量是对pH敏感的绿色荧光蛋白表达的酵母启动子的控制下，酵母pHluorin所指示。在荧光计中的酵母细胞悬浮液的荧光比的测量方法进行说明。通过这些协议，单一时间点的pH值测量不同条件下或在不同的酵母突变体进行了比较，并已监测pH值的变化随着时间的推移。这些方法也适合于高通量实验的荧光板读数器的格式。比例比其他AP的pH测量的优点接近目前的用途，潜在实验的问题和解决方案，以备将来使用这些技术的前景也有所说明。
Introduction
pH值的平衡是一个充满活力和高度调节的过程中，在所有的生物1,2。生化过程严格监管的pH值，细胞内环境的调整，以使优化常住酶的活性狭窄的pH值范围。然而，细胞内pH稳态可以挑战的快速变化环境的pH值，代谢变化，以及某些信号传导通路。此外，细胞内pH值本身可以作为一个重要的信号。最后，许多细胞器保持腔的pH值是不同于周围的胞质溶胶和必需的细胞器的特定功能。
酵母酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）股数与高等真核生物2的pH的体内平衡机制。酸性细胞内吞/溶酶体途径，pH值主要控制高度保守的空泡质子转运ATP酶（V-ATP酶），随许多EXCHAN蒙古包依赖于pH梯度。所有真核细胞中也有质子出口机制。在真菌和植物，在质膜上的第二，不同的质子泵，PMA1，出口代谢质子和被认为是细胞内pH值和细胞膜电位的主要决定因素。 S.遗传灵活性酵母和其商业上的重要性，提出了一个非常有趣和重要的研究pH值稳态模型2。
除了细胞器酸化的主要驱动，V-ATP酶被高度管制的酶和我们实验室的兴趣了解V-ATPase的调节机制。为了实现这一目标，我们一直在使用液泡和胞质pH值在体内 pH值的测量：1）监测反应改变外条件，如葡萄糖的剥夺和readdition，2）审查突变，妥协V-ATPase活性的影响， 3）探索COORdination细胞器和质膜质子泵3-5。这些实验通过强劲的比例适合于使用在酵母细胞中的pH值指标的发展才成为可能。厂房等人首先表明，BCECF（2'7'-二（2 -羧基乙基）-5 – （6） -羧基荧光素），它已被广泛应用，以测量细胞内pH值在哺乳动物细胞中，积聚在酵母液泡而不是在细胞质6。这种差异在BCECF本地化已被归因于液泡中的水解酶，这是有可能负责裂解乙酰氧甲基酯BCECF-AM（乙酰氧基甲基酯，BCECF）和液泡保留6。阿里等人进一步开发的液泡pH测量使用BCECF，适应这些测量荧光酶标仪格式。布莱特等人介绍了酵母pHluorin所指示由表达质粒源性ŗ的在酵母细胞内pH值的测定作为一种手段pH敏感的绿色荧光蛋白atiometric 8酵母特异性启动子的控制下9。
BCECF酵母pHluorin所指示的激发光谱是对pH敏感的，因此它们被用作比例的pH值如下：两个激发波长，在一个单一的发射波长测量，荧光的比例提供了一个衡量的pH为8,10。这些酵母液泡和胞质pH传感器已用于单细胞和人口为基础的测量。 6,11测量单细胞进行荧光显微镜和图像分析。液泡膜或胞浆上面的两个波长的荧光的测量为每个小区。人口为基础的测量进行适当的荧光功能酶标仪或荧光计中。我们通常是在荧光计测量，因为它提供了方便添加组件，如葡萄糖在con连续动力学测量。下面列出我们目前实验室协议液泡和胞质pH值的测量，二者也容易适应微孔板检测。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们利用这些协议处理若干方面的pH稳态。例如，我们已经比较4,5野生型和V-ATP酶缺陷的突变细胞的细胞质和pH响应。我们还研究改变生长条件，尤其是细胞外pH值，葡萄糖3液泡pH响应的影响。重要的是，我们观察到的响应都与其它方法定量的pH测量和一致的生化数据，描述改变质子泵活动。
这里所描述的两个最重要的功能不同的体内 pH测量的荧光基团的…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由美国国立卫生研究院R01 GM50322支持到PM凯恩。作者感谢pHluorin所指示的酵母质粒和建议比例pH值测量的约翰斯·霍普金斯大学博士饶Rajini，，凯莱博士A.马丁内斯·穆尼奥斯这些协议，我们的实验室工作。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Spectrofluorometer | Horiba Jobin Yvon | Model Fluoromax-4 | Temperature control and stirring capability are desirable. |
| BCECF-AM | Invitrogen/Molecular Probes | B1150 | Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C |
| monensin | Sigma | M5273 | Toxic. |
| nigericin | Sigma | N7143 | Toxic. |
| MES | Sigma | M8250 |
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