Post-embedding immunogold mærkning af synaptiske proteiner i hippokampalskivekulturer

Summary

Lokalisering og fordeling af proteiner giver vigtige oplysninger for at forstå deres cellulære funktioner. Den overlegne rumlig opløsning af elektronmikroskopi (EM) kan anvendes til at bestemme den subcellulære lokalisering af et givet antigen efter immunohistokemi. Til væv i centralnervesystemet (CNS), at bevare strukturel integritet under opretholdelse af antigenicitet er særlig vanskeligt i EM-studier. Her, vælger vi en fremgangsmåde, der har været anvendt til at bevare strukturer og antigener i CNS til undersøgelse og karakterisering af synaptiske proteiner i rotte-hippocampale CA1 pyramidale neuroner.

Abstract

Immunoelektronmikroskopi er et kraftfuldt værktøj til at studere biologiske molekyler på det subcellulære niveau. Antistoffer koblet til elektrontætte markører såsom kolloidalt guld kan afsløre lokaliseringen og fordelingen af specifikke antigener i forskellige væv ^1. De to mest anvendte teknikker er før indlejring og efter indlejring teknikker. I præ-indlejring immunogold-elektronmikroskopi (EM) teknikker, skal vævet permeabiliseres for at tillade antistof penetration før det er indlejret. Disse teknikker er ideelle til konservering strukturer, men dårlig penetration af antistoffet (ofte kun de første få mikrometer) er en væsentlig ulempe ^2. De post-indlejring mærkningsmetoder kan undgå dette problem, fordi mærkningen finder sted på sektioner af faste væv, hvor antigener er mere let tilgængelige. I årenes løb er et antal modifikationer forbedret efter indlejring metoder til at øge immunreaktivitet og bevare ultrastruktur <sup> 3-5.

Vævsfiksering er en afgørende del af EM undersøgelser. Fikseringsmidler kemisk tværbinde makromolekylerne at låse vævsstrukturer på plads. Valget af fixativ påvirker ikke kun strukturel konservering, men også antigenicitet og kontrast. Osmiumtetroxid (OSO _4), formaldehyd og glutaraldehyd har været standard fiksativer i årtier, herunder for det centrale nervesystem (CNS) væv, der er særlig tilbøjelige til strukturelle skader i løbet af kemisk og fysisk behandling. Desværre er OSO ₄ er meget reaktiv og har vist sig at maskere antigener ^6, hvilket resulterer i dårlig og utilstrækkelig mærkning. Alternative metoder til at undgå kemisk fiksering omfatte frysning af væv. Men disse teknikker er vanskelige at udføre og kræver dyre instrumenter. For at løse nogle af disse problemer og forbedre CNS-væv mærkning, Phend et al. erstattet OSO ₄ med uranylacetat (UA) og garvesyre ACId (TA), og med held indført yderligere ændringer for at forbedre følsomheden af påvisning af antigen og strukturel bevarelse i hjerne og rygmarv væv ^7. Vi har vedtaget denne osmium-fri post-embedding metode til at rotte hjernevæv og optimeret immunogold mærkning teknik til at opdage og studere synaptiske proteiner.

Vi præsenterer her en fremgangsmåde til bestemmelse af ultrastrukturelle lokalisering af synaptiske proteiner i rotte-hippocampale CA1 pyramidale neuroner. Vi bruger organotypiske hippocampal dyrkede skiver. Disse skiver bevare trisynaptic kredsløb i hippocampus, og er således særligt anvendelige til at studere synaptisk plasticitet, en mekanisme bredt menes at ligge til grund for indlæring og hukommelse. Organotypiske hippocampale snit fra postnatal dag 5 og 6 mus / rotteunger kan fremstilles som beskrevet tidligere ^8, og er især nyttige til akut knockdown eller overudtrykker exogene proteiner. Vi har tidligere brugt denne protokol til characterize neurogranin (Ng), et neuron-specifikt protein med en kritisk rolle i reguleringen af synaptiske funktion ^8,9. Vi har også anvendt den til at karakterisere den ultrastrukturelle lokalisering af calmodulin (CaM) og ^{Ca2 +} / CaM-afhængige proteinkinase II (CaMKII) ^10. Som illustreret i de resultater, denne protokol giver mulighed for god ultrastrukturelle bevarelse af dendritiske Torner og effektiv mærkning af Ng at hjælpe karakterisere sin distribution i ryggen ^8. Endvidere kan denne fremgangsmåde, har bred anvendelighed i at studere mange andre proteiner involveret i neuronale funktioner.

Protocol

1. Fiksering Fikseringsmidler er kræftfremkaldende, handsker og håndtere fiksativer i et stinkskab. Medmindre andet er bemærket, er alle inkubationer udført på is, og alle opløsninger skal filtreres inden brugen. Anvender elektron-mikroskopi-reagenser. Dag 1 Efter forsøgsbetingelser (fx viral injektion, lægemiddelbehandling), anbringes membranen med organotypiske hippocampusskiver i en 60 x 15 mm polystyren petriskål…

Representative Results

Figur 2B viser et eksempel på fordelingen af endogene Ng molekyler i dendritiske spidser i CA1-hippocampale pyramidale neuroner. Nikkel net med ultratynde (60 nm) væv, der indeholder CA1-regionen af hippocampus (som det ses i figur 2A) blev dækket med 1% T / PB, 50 mM glycin, derefter blokeret med 2,5% BSA og 2,5% serum før inkubation med anti -Ng-antistof. Efter vask med T / PB, blev gitre derefter dækket med anti-kanin sekundært antistof koblet til 10 nm guld. Endelig blev gitre…

Discussion

I denne protokol, har vi vedtaget Phend og Weinberg metode til hjerne og rygmarv væv til at studere dendritiske Torner i rotte hippokampalskivekulturer. Dendrit udløberne i hippocampus CA3-CA1 område er sarte strukturer, der indeholder en bred vifte af proteiner, der spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​neuronale funktioner. I denne procedure giver en afbalanceret tilgang til at opnå øget antigenicitet under opretholdelse af god ultrastrukturelle præservering (figur 2A), hvilket tillade…

Materials

NAME OF REAGENT	COMPANY	CATALOG NUMBER
60 x 15 mm polystyrene Petri dish	Falcon	351007
Disposable scalpel	EXELINT	29552
Cell culture inserts	Millipore	PICM03050
10 nm Goat-anti-rabbit gold	Electron Microscopy Sciences	25108
Anti-Neurogranin antibody	Millipore	AB5620
100% Picric acid	Electron Microscopy Sciences	19550
96% Paraformaldehyde	Acros Organics	AC41678-0030
25% Glutaraldehyde (EM grade)	Sigma	G5882
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
p-Phenylenediamine	Sigma	P6001
Platinum (IV) chloride	Sigma	379840
Tannic acid	Electron Microscopy Sciences	21710