Сочетание иммунопреципитации хроматина и сверхвысокой пропускной последовательности (чип-далее) может определять и белок-ДНК взаимодействия в данной линии ткани или клетки. Изложенные в том, как генерировать высокое качество щепы шаблон для последующего секвенирования, используя опыт с TCF7L2 транскрипционный фактор в качестве примера.
Обломок-последовательности (чип-далее) методы непосредственно предложить целого генома охвата, где объединение иммунопреципитации хроматина (чип) и массивных параллельных последовательностей могут быть использованы для идентификации репертуара млекопитающих ДНК связаны факторов транскрипции в естественных условиях. "Следующего поколения" секвенирование генома технологии обеспечивают 1-2 порядков увеличение количества последовательностей, которые могут быть экономически эффективно генерируются на старые технологии что позволяет чип-далее методы для непосредственного предоставления целого генома покрытия для эффективного профилированию млекопитающего белок-ДНК взаимодействий.
Для успешного чип-последующие подходы, необходимо генерировать высокое качество чип ДНК-матрицы для получения наилучших результатов секвенирования. Описание основано вокруг опыт работы с белкового продукта гена наиболее сильно вовлечены в патогенез сахарного диабета 2 типа, а именно транскрипции фактора транскрипции фактора 7-подобный 2 (TCF7L2). Этот фактор также вовлечен в различные виды рака.
Изложенные в том, как генерировать высокое качество щепы ДНК-матрице, полученные из клеточной линии колоректального рака, HCT116, в целях создания высокого разрешения карты по виртуализации, чтобы определить гены связаны TCF7L2, давая дальнейшее понимание в свою ключевую роль в патогенезе сложных признаков.
На протяжении многих лет наблюдается неудовлетворенная потребность определить набор генов связаны и регулируются геном данного белка широко, в частности, в классе фактора транскрипции.
Одом и соавт. 1 использован иммунопреципитацию хроматина (чип) в сочетании с промоутером микрочипов в систематическом выявлении генов занимают заранее оговоренное транскрипционных регуляторов в человеческой печени и панкреатических островков. Впоследствии Джонсон и др.. 2 разработана крупномасштабная хроматин иммунопреципитации на основе прямых ультра высокой пропускной секвенирования ДНК (чип-след), чтобы всесторонне карту белок-ДНК взаимодействия по всей геномах млекопитающих. В качестве теста случае, они отображаются в естественных условиях связывания нейронов-ограничительные глушителем фактора (NRSF) до 1946 мест в геноме человека. Отображаемые данные высоким разрешением связывания позиции (+ 50 пар оснований), что способствовало как яsolation мотивов и выявления NRSF-связывающих мотивов. Эти чипсеты-SEQ данных также была высокой чувствительностью и специфичностью и статистической достоверности (p <10 -4), свойств, которые важны для выведения новых взаимодействий кандидата.
Робертсон и др.. 3 также используется чип-SEQ с целью картирования STAT1 цели в γ-интерферона (IFN-γ) стимулировали и нестимулированных человека HeLa S3 клетки в живом организме. Чип-SEQ, используя 15,1 и 12,9 млн. однозначно отображается последовательность читает, и, по оценкам, ложных открытие менее 0,001, они определили 41 582 и 11 004 предполагаемых STAT1-связывающие области в стимулированных и стимулированных клеток соответственно. Из 34 локусов как известно, содержат STAT1-интерферона реагировать сайты связывания 4-8, чип-далее найдены 24 (71%). Обломок-SEQ цели были обогащены последовательности похожи на известные STAT1 связывающие мотивы. Сравнения с двумя существующими чип-PCR наборы данных предложеночто чип-сл чувствительность была между 70% и 92%, а специфичность была по крайней мере 95%. Кроме того, было ясно, что чип-SEQ предлагает как низкий аналитической сложности и чувствительности, которая увеличивается с глубиной секвенирования.
Таким образом, геном "следующего поколения" секвенирования технологии обеспечивают 1-2 порядков увеличение количества последовательностей, которые могут быть экономически эффективно генерируются на старых технологий 9. Обломок-SEQ методами таким образом, напрямую обеспечит целого генома для эффективного охвата профилирование млекопитающих белок-ДНК взаимодействия 3.
В 2006 году в сильной ассоциации из вариантов фактора транскрипции 7-подобный 2 (TCF7L2) гена с диабетом 2 типа был обнаружен 10. Другие исследователи уже самостоятельно реплицировать этот вывод в разных национальностей и, что интересно, с первого генома широкие исследования ассоциации диабета 2 типа опубликованы в Nature 11,12 </sвверх>, науки и в других местах 13-15 16,17, самая сильная связь была действительно с TCF7L2; этого в настоящее время считается наиболее значительные генетические нахождения в сахарный диабет 2 типа на сегодняшний день 18-20. Кроме того, TCF7L2 была связана с риском рака 21,22, более того, эта связь стала более очевидной, когда локус 8q24 выявленные геномом широкого исследования ассоциативного ряда злокачественных опухолей, включая колоректальный рак, было показано, что в связи с крайним вверх TCF7L2-связывающим элементом, вызывающим транскрипции MYC 23,24. Таким образом, существует огромный интерес в определении нижестоящих генов регулируется настоящим ключевым фактором транскрипции.
На основе опыта TCF7L2 как пример методологии, в настоящем документе описывается, как генерировать высокое качество чип ДНК. Чип проводили в толстой клеточной линии карциномы, НСТ116, для последующего секвенирования с целью создания высокого резольногоution карту генов связаны TCF7L2 25 в попытке получить дальнейшее понимание в свою ключевую роль в патогенезе сложных признаков.
Это теперь возможно проводить генома профиля белок-ДНК взаимодействия ассоциации с помощью чип-далее, как было недавно продемонстрировано с другими факторами транскрипции 2,3. Ключ к успешным результатам секвенирования поколения высокого качества шаблона хроматина ДНК иммуноп?…
The authors have nothing to disclose.
Работа выполнена при поддержке Института развития премию из Детской больницы Филадельфии.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
EZ-ChIP Kit | Millipore | 17-371 | |
GoTaq Hot Start Polymerase | Promega | M5001 | |
Misonix Sonicator | Qsonica | XL-2000 | |
NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo-Scientific | ||
Positive control primer sequences (TCF7L2-1) Forward- 5′-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3′ Reverse- 5′-GCTCACCTCCTGTATCTTCG-3′ Negative control primer sequences (CTRL-1) Forward-5′-ATGTGGTGTGGCTGTGATGGGAAC-3′ Reverse- 5′-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3′ |