דור של רקמות שריר לב פונקציונליות מזדהות באמצעות הדפסת microcontact
Summary
הדור של רקמת שריר לב מיושר הוא דרישת מפתח להתאמת ההתקדמות בביולוגיה של תאי גזע למטרות שימושיות מבחינה קלינית. להלן נתאר גישת הדפסת microcontact לשליטה המדויקת של צורת תא ותפקודו. שימוש באוכלוסיות מטוהרות מאוד של תאי גזע עובריים מופקים אבות לב, אז אנחנו מייצרים רקמת שריר לב מתפקד איזוטרופי.
Abstract
אי ספיקת לב מתקדמת מהווה אתגר קליני מסופק עיקרי, הנובעת מהאובדן של תאי שריר לב קיימא ו / או תפקודיים באופן מלא. למרות טיפול תרופתי אופטימלי, אי ספיקת לב מהווה גורם מוביל לתמותה ותחלואה בעולם המפותח. אתגר עיקרי בפיתוח תרופה הוא זיהוי של מבחנים סלולריים במדויק לסכם פיזיולוגית שריר לב אנושית בריאה וחולה במבחנה. כמו כן, את האתגרים המרכזיים בביולוגית לב משובים סובבים סביב זיהוי והבידוד של אבות לב מטופל ספציפיים בכמויות רלוונטיות קליני. תאים אלה צריכים אז להרכיב לתוך רקמה פונקציונלית דומות לארכיטקטורת רקמת לב הילידים. הדפסת microcontact מאפשרת יצירה של צורות חלבון micropatterned מדויקות המזכירות ארגון מבני של הלב, ובכך לספק רמזים גיאומטריים לשלוט הידבקות התא מרחבית. בזהאנו מתארים את הגישה שלנו לבידוד של תאי שריר לב המטוהר ביותר מתאי הגזע pluripotent המבדיל במבחנה, הדור של משטחי צמיחת תא micropatterned עם חלבונים תאיים מטריקס, וההרכבה של תאי גזע המופקים מתאי שריר הלב לתוך רקמת שריר הלב איזוטרופי.
Introduction
למרות התקדמות בטיפול רפואי, אי ספיקת לב מתקדמת נשארה גורם מוביל לתמותה ותחלואה בעולם המפותח. התסמונת הקלינית נובעת מאובדן של רקמת שריר לב פונקציונלית ובהמשך חוסר יכולת של לב לא מצליח לענות על הדרישות מטבוליות של אנשים מושפעים. מאז הלב יש יכולת התחדשות מוגבלת, השתלת לב אוטולוגית היא הטיפול היחיד הנוכחי קבל קליני המכוונים במישרין חידוש רקמת לב מתפקד לאיבוד. חסרונות משמעותיים של השתלת לב, כולל מספר מוגבל של לבבות תורמים ואת הצורך בטיפול לדיכוי חיסוני לטווח ארוך, למנוע את השימוש הנרחב של טיפול זה. כתוצאה מכך, טיפול הרפואי היה עמוד התווך של טיפול בחולים עם מחלת לב. אתגר עיקרי בפיתוח תרופה הוא זיהוי של מבחנים סלולריים במדויק לסכם פיזיולוגית שריר לב בריאה וחולה, במבחנה.
ההתכנסות האחרונה של טכנולוגיית הנדסת רקמות וביולוגיה של תאי גזע מעלה אפיקים מבטיחים חדשים להתחדשות לב. יצירת רקמת שריר לב פונקציונלית ממקור מתחדש מטופל ספציפי תהיה התקדמות גדולה בתחום. היכולת זו תאפשר לפיתוח מבחנים סלולריים ספציפיים לפיתוח תרופה למחלות וגילוי והייתי להניח את היסודות לרפואת רגנרטיבית לב. תאי גזע עוברי אנושיים (ES) ומה שחשוב יותר, תאי גזע pluripotent מושרים אדם (IPS) מייצגים מקור פוטנציאלי מתחדש מטופל ספציפי של תאי אב חדרית וחדרית myocytes הבוגר. שילוב של ביולוגיה של תאי גזע והנדסת רקמות אסטרטגיות מטפל בבעיה על ידי יצירת רקמת לב מתפקדת במבחנה שיכול לשמש בפיתוח של מבחנים סלולריים לגילוי סמים או בגישות משובי לב לטיפול באי ספיקת לב מתקדם.
_content "> אתגר מרכזי בהתחדשות לב כבר זיהוי של סוג תא אופטימלי. מגוון רחב של תאים נחקר 1, אך עד היום, למרות שמבשרי קרדיוגני multipotent שונים ממקורות שונים כבר גילו, זיהוי של תא המקור שעונה על דרישות קריטיות כגון מחויבות לגורל התא myogenic, תחזוקה של היכולת להרחיב in vivo או במבחנה והרכבו לרקמת שריר לב פונקציונלית הוכיח להיות בעיה מרכזית 2. כבר תארו מערכת עכברית מהונדסת כפולה בעבר המאפשר בידוד של אוכלוסיות מטוהרות של אבות מחויבים חדרית (CVP) מתאי גזע עוברי במבחנה המבדילה מאוד. אנחנו שנוצרנו עכבר מהונדס כפול רומן שמבטא את חלבון פלואורסצנטי האדום dsRed תחת שליטתו של משפר Isl1 תלוי של הגן וMEF2c החלבון פלואורסצנטי הירוק המשופר בשליטהלב הספציפי Nkx2.5 המשפר. בהתבסס על מערכת זו שני צבעי ניאון כתב, אבות ראשונים ושניים בלב שדה מתאי גזע עוברי מתפתחים שאפשר לבודד באמצעות מיון פלואורסצנטי הופעל תא (FACS) על פי הביטוי של MEF2c וNkx2.5 גנים שלהם. CVP להידמות myocytes לב המבוסס על דפוסי הביטוי של סמני שריר לב ואיכויות מבניות ותפקודיות 3, מה מציע הבטחה גדולה למטרות התחדשות רקמת לב.למרות שיש כבר התקדמות הרבה בתחום הנדסת רקמות, מחק ארכיטקטורת הסלולר מולדת נשאר אתגר מרכזי. שיטות מקובלות להתמודדות עם אתגר זה כוללים זריעת פיגומים ביולוגיים או סינטטיים עם תאים במבחנה. בשל מספר החסרונות של פיגומים, כולל פירוק מהיר, יציבות פיזית ומכאנית מוגבלת וצפיפות הנמוכה של תאי 1,4,5, יש לנו ניסינו להנדס פיגום פחות רקמות. Altתאי לב אף יכולים לשנות microenvironment המקומי שלהם על ידי ההפרשה של חלבונים תאיים מטריקס, יש להם יכולת מוגבלת יותר להתארגן לmyocytes לב בצורת המוט בהיעדר רמזים תאיים. לפיכך, תבנית שמספקת תאי רמזים מרחביים וביולוגיים מתאימים לרקמת שריר לב מרכיבים פונקציונלית נדרשת. הדפסת microcontact מטפלת האתגר הזה על ידי מתן טכניקה פשוטה וזולה לשלוט במדויק צורת תא, ארגון ותפקוד 6-8, כל אלה הם קריטיים עבור הדור של רקמת שריר לב מתפקד מיושרת. היא כוללת שימוש בבולי microtextured polydimethylsiloxane (PDMS) עם גדלי תכונה הנעים במורד עד 2 מיקרומטר 9 שיאפשר התצהיר של חלבונים תאיים מטריקס על גבי מצעי PDMS בדפוסים מדויקים ובכך להשפיע על הידבקות התא מרחבית.
בזאת, אנו מציעים לשלב טכנולוגית bioengineering רקמות עם הגזע cell ביולוגיה ליצור רקמת שריר לב מתפקד איזוטרופי. בהתאם לכך, אנחנו כאן להפגין הגישה שפורסמה לאחרונה את הדברים הבאים: (1) את הדור של משטחי חלבון micropatterned על PDMS מצעים ידי הדפסת microcontact עבור הדור של תבנית לרקמת שריר לב בציר, (2) הבידוד של מטוהר אבות לבביים מאוד מ תאי גזע עוברי הבחנה במבחנה, ו( 3) שילוב של שתי הטכניקות ליצירת רקמת שריר לב מיושר פונקציונלית.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה, הציג שיטה לבודדות אוכלוסיות מטוהרות של אבות קרדיוגני ולזרעם על מצעי micropatterned פיברונקטין מה מאפשר להם ליישר ולקחת צורת מוט myocyte דמוית לב. ארגון סלולרי רגיל הוא קריטי לתפקוד תקין רקמה 8,10, בפרט לרקמת שריר לב. myocytes הלבבי הוכח לפתח 11,12 השתפרו מכאני?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו בוצעה בחלקו במרכז ננו מערכות (CNS), חבר ברשת הלאומית לננוטכנולוגיה תשתיות (NNIN), אשר נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע בפרס NSF לא. ECS-0335765. מערכת עצבים המרכזיים היא חלק מאוניברסיטת הרווארד.
Materials
| Name of Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Prepare 0.1M solution in ddH2O |
| Desiccator, Vacuum 10 inch | Nova-Tech International, Inc. | 55206 | |
| 4′,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| FACSAria II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum ES cell-grade | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Fetal Bovine Serum Differentiation-grade | Gemini Bio-Products | 100-500 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F4759 | Solubilize to 1 mg/ml in ddH2O |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 22x22mm | Fisher Scientific | 12-548-B | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | Prepare 0.1% solution in ddH2O |
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc. | PWM32-PS-CB15 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium | Thermo Scientific | SH30228.01 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | Self-prepared from LIF-secreting cell lines | Prepare 500x stock solution | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Harvested from day 12-15 mouse embryos | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Prepare 1% solution in ddH2O |
| Round-Bottom Tube with 35 μm cell strainer | BD Biosciences | 352235 | |
| SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner | SPI Supplies | 11005-AB | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Vacuum Gauge | SPI Supplies | 11019-AB |
References
- Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. Regenerating functional heart tissue for myocardial repair. Cell Mol. Life Sci. , (2012).
- Chien, K. R., Domian, I. J., Parker, K. K. Cardiogenesis and the complex biology of regenerative cardiovascular medicine. Science. 322, 1494-1497 (2008).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326, 426-429 (2009).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur. Spine J. 17, 467-479 (2008).
- Eschenhagen, T., Eder, A., Vollert, I., Hansen, A. Physiological aspects of cardiac tissue engineering. Am. J. Physiol Heart Circ Physiol. 303, H133-H143 (2012).
- Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317, 1366-1370 (2007).
- Li, F., Li, B., Wang, Q. M., Wang, J. H. Cell shape regulates collagen type I expression in human tendon fibroblasts. Cell Motil. Cytoskeleton. 65, 332-341 (2008).
- Sarkar, S., Dadhania, M., Rourke, P., Desai, T. A., Wong, J. Y. Vascular tissue engineering: microtextured scaffold templates to control organization of vascular smooth muscle cells and extracellular matrix. Acta Biomater. 1, 93-100 (2005).
- Isenberg, B. C., Wong, J. Y. Building structure into engineered tissues. Materials Today. 9, 54-60 (2006).
- Athanasiou, K. A., Zhu, C., Lanctot, D. R., Agrawal, C. M., Wang, X. Fundamentals of biomechanics in tissue engineering of bone. Tissue Eng. 6, 361-381 (2000).
- Feinberg, A. W., et al. Controlling the contractile strength of engineered cardiac muscle by hierarchal tissue architecture. Biomaterials. 33, 5732-5741 (2012).
- Black, L. D., Meyers, J. D., Weinbaum, J. S., Shvelidze, Y. A., Tranquillo, R. T. Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification. Tissue Eng. Part A. 15, 3099-3108 (2009).
- Kim, D. H., et al. Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 565-570 (2010).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur. Cell Mater. 18, 1-14 (2009).
- Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple approach to micropattern cells on common culture substrates by tuning substrate wettability. Tissue Eng. 10, 865-872 (2004).
- Leu, M., Ehler, E., Perriard, J. C. Characterisation of postnatal growth of the murine heart. Anat. Embryol. (Berl). 204, 217-224 (2001).
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J. Mol. Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Porrello, E. R., et al. Heritable pathologic cardiac hypertrophy in adulthood is preceded by neonatal cardiac growth restriction. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 296, 672-680 (2009).
- Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285, H2355-H2363 (2003).
- Ohler, A., et al. Two-photon laser scanning microscopy of the transverse-axial tubule system in ventricular cardiomyocytes from failing and non-failing human hearts. Cardiol. Res. Pract. 2009, 802373 (2009).
- Takahashi, H., Nakayama, M., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Anisotropic cell sheets for constructing three-dimensional tissue with well-organized cell orientation. Biomaterials. 32, 8830-8838 (2011).
- Williams, C., Xie, A. W., Yamato, M., Okano, T., Wong, J. Y. Stacking of aligned cell sheets for layer-by-layer control of complex tissue structure. Biomaterials. 32, 5625-5632 (2011).
