Generasjon av alliansefrie Funksjonell Myocardial Tissue Gjennom Microcontact Printing
Summary
Generering av justert hjerteinfarkt vev er en viktig forutsetning for å tilpasse de siste fremskritt i stamcelleforskningen biologi til klinisk nyttige formål. Heri vi beskrive en microcontact trykkteknikker tilnærming for presis kontroll av cellen form og funksjon. Ved hjelp av høyt rensede bestander av embryonale stamceller hentet kardiale stamceller, vi deretter generere anisotrop funksjonell hjerteinfarkt vev.
Abstract
Avansert hjertesvikt representerer et viktig udekket klinisk utfordring, som oppstår fra tap av levedyktige og / eller fullt funksjonell hjertemuskelceller. Til tross for optimal medikamentell behandling, representerer hjertesvikt en ledende årsak til dødelighet og sykelighet i den industrialiserte verden. En stor utfordring i legemiddelutvikling er identifisering av cellulære analyser som nøyaktig rekapitulere normalt og sykt menneske hjerteinfarkt fysiologi in vitro. Likeledes, de store utfordringene i regenerativ hjertestans biologi dreie seg om identifisering og isolering av pasient-spesifikke kardiale stamceller i klinisk relevante mengder. Disse cellene må da settes sammen til funksjonelle vev som ligner den opprinnelige hjertet vev arkitektur. Microcontact utskrift gir mulighet for etablering av presise micropatterned protein former som minner strukturelle organiseringen av hjertet, og dermed gi geometriske signaler for å styre celleadhesjon romlig. Herivi beskriver vår tilnærming for isolering av høyt renset myokard celler fra pluripotente stamceller differensierende in vitro, generering av cellevekst overflater micropatterned med ekstracellulære matriksproteiner, og montering av stammen celle-avledede hjertemuskelceller inn anisotrope myokardial vev.
Introduction
Til tross for nylige fremskritt innen medisinsk behandling, gjenstår avansert hjertesvikt en ledende årsak til dødelighet og sykelighet i den industrialiserte verden. Den kliniske syndromet oppstår fra et tap på funksjonell hjerteinfarkt vev og deretter en manglende evne til sviktende hjerte til å møte de metabolske kravene berørte personer. Siden hjertet har en begrenset evne til reproduksjon, er autolog hjertetransplantasjon den eneste nåværende klinisk akseptert behandling direkte rettet mot å fylle tapt funksjonelle hjerte vev. Betydelige ulemper av hjertetransplantasjon, inkludert begrenset antall donor hjerter og behovet for langsiktig immunsuppressiv behandling, utelukke store spredningen bruk av denne terapien. Som et resultat, har medisinsk behandling vært bærebjelke i behandling for pasienter med hjertesykdom. En stor utfordring i legemiddelutvikling er identifisering av cellulære analyser som nøyaktig rekapitulere normalt og sykt hjerteinfarkt fysiologi in vitro.
Den nylige konvergens av stamcelleforskningen biologi og tissue engineering teknologi reiser nye lovende muligheter for hjerte gjenfødelse. Generere funksjonell hjerteinfarkt vev fra en fornybar pasient-spesifikke kilde ville være et stort fremskritt i feltet. Dette vil tillate for utvikling av sykdom spesifikke cellulære analyser for legemiddelutvikling og oppdagelse ville legge grunnlaget for hjerte regenerativ medisin. Humane embryonale stamceller (ES-celler), og mer betydelig, menneskeskapt påvirkning pluripotent stilk (IPS) celler representerer en potensielt fornybar pasient-spesifikke kilde ventrikulære stamceller og modne ventrikulære myocytes. Kombinasjonen av stilk cellebiologi og tissue engineering strategier løser dette problemet ved å generere funksjonelle hjerte vev in vitro som kan brukes i utviklingen av cellulære analyser for medisiner eller kardiale regenerative tilnærminger for behandling av avansert hjertesvikt.
_content "> En sentral utfordring i kardial regenerering har vært identifiseringen av en optimal celletype. Et bredt utvalg av celler har blitt studert 1 imidlertid til dags dato, selv om ulike multipotent kardiogent forløpere fra ulike kilder har blitt oppdaget, identifisering av en celle kilde som oppfyller kritiske krav som forpliktelse til myogenic cellen skjebnen at vedlikeholdet av kapasiteten til å ekspandere i vivo eller de vitro, og blandingen til en funksjonell myokardisk vev vist seg å være et sentralt problem 2. Vi har tidligere beskrevet en dobbel transgene murin system som muliggjør isolering av sterkt rensede populasjoner av engasjerte ventrikulære progenitors (CVP) fra ES-celler differensierer in vitro. Vi genererte en roman dobbel transgene mus som uttrykker den røde fluorescerende protein dsRed under kontroll av en Isl1-avhengige enhancer av MEF2c genet og den forbedrede grønt fluorescerende protein under kontroll avhjertets-spesifikke Nkx2.5 enhancer. Basert på denne to-farget fluorescerende reporter system, første og andre hjerte felt progenitorer fra utviklingsland ES celler kan isoleres ved hjelp av fluorescens Aktivert Cell Sortering (FACS) i henhold til deres ekspresjon av MEF2c og Nkx2.5 gener. CVP ligner hjerte myocytes basert på uttrykket mønstre av hjerteinfarkt markører og strukturelle og funksjonelle kvaliteter 3, hva tilbyr store løftet for hjertevev regenerative formål.Selv om det har vært mange fremskritt innen tissue engineering, hermet innfødt mobilnettet arkitektur fortsatt en sentral utfordring. Konvensjonelle metoder for å løse denne utfordringen er seeding biologiske eller syntetiske stillasene med celler de vitro. Grunnet en rekke ulemper av stillas, inkludert rask nedbrytning, begrenset fysisk og mekanisk stabilitet og lav celletetthet 1,4,5, har vi forsøkt å konstruere stillas mindre vev. AltHough hjerteceller kan modifisere deres lokale mikromiljø av sekresjon av ekstracellulære matriksproteiner, de har en mer begrenset kapasitet til å organisere seg stavformede kardiale myocytes i fravær av ekstracellulære signaler. Dermed er en mal som gir celler hensiktsmessige romlige og biologiske signaler å komponere funksjonell hjerteinfarkt vev nødvendig. Microcontact utskrift løser denne utfordringen ved å tilby en enkel og rimelig metode for å nøyaktig kontroll cellen form, organisasjon og funksjon 6-8, som alle er avgjørende for generering av justert funksjonelle hjerteinfarkt vev. Det omfatter anvendelse av microtextured Polydimethylsiloxane (PDMS) frimerker med funksjonen størrelser spenner ned til 2 um 9 som aktiverer avsetting av ekstracellulære matriksproteiner bort PDMS substrater i presise mønstre og dermed å påvirke celleadhesjon romlig.
Heri, foreslår vi å kombinere vev bioteknologi teknologi med stilk cell biologi for å generere anisotrope funksjonell hjerteinfarkt vev. Følgelig, vi her vise vår nylig publiserte tilnærming for følgende: (1) generering av micropatterned protein flater på PDMS substrater etter microcontact trykkteknikker for generering av en mal for justert myokardial vev, (2) isolering av høyt renset kardiale stamfedre fra ES celler differensierende in vitro, og (3) kombinasjonen av begge teknikker for å generere funksjonelle justert myokardial vev.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokollen, presenterte vi en metode for å isolere rensede bestander av kardiogent forfedre og til frø dem på micropatterned fibronektin underlag hva tillater dem justere og ta en hjertestans myocyte-lignende stang form. Normal cellulær organisasjon er avgjørende for normal vev funksjon 8,10, særlig for myokardial vev. Hjertemuskelceller har vist seg å utvikle forbedret mekanisk 11,12 og elektrofysiologiske egenskapene 11,13 når danne anisotrop celle matriser. Siden kard…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble utført i en del ved Senter for nanoskala Systems (CNS), medlem av National Nanoteknologi Infrastructure Network (NNIN), som er støttet av National Science Foundation i henhold NSF award no. ECS-0335765. CNS er en del av Harvard University.
Materials
| Name of Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Prepare 0.1M solution in ddH2O |
| Desiccator, Vacuum 10 inch | Nova-Tech International, Inc. | 55206 | |
| 4′,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| FACSAria II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum ES cell-grade | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Fetal Bovine Serum Differentiation-grade | Gemini Bio-Products | 100-500 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F4759 | Solubilize to 1 mg/ml in ddH2O |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 22x22mm | Fisher Scientific | 12-548-B | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | Prepare 0.1% solution in ddH2O |
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc. | PWM32-PS-CB15 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium | Thermo Scientific | SH30228.01 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | Self-prepared from LIF-secreting cell lines | Prepare 500x stock solution | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Harvested from day 12-15 mouse embryos | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Prepare 1% solution in ddH2O |
| Round-Bottom Tube with 35 μm cell strainer | BD Biosciences | 352235 | |
| SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner | SPI Supplies | 11005-AB | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Vacuum Gauge | SPI Supplies | 11019-AB |
References
- Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. Regenerating functional heart tissue for myocardial repair. Cell Mol. Life Sci. , (2012).
- Chien, K. R., Domian, I. J., Parker, K. K. Cardiogenesis and the complex biology of regenerative cardiovascular medicine. Science. 322, 1494-1497 (2008).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326, 426-429 (2009).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur. Spine J. 17, 467-479 (2008).
- Eschenhagen, T., Eder, A., Vollert, I., Hansen, A. Physiological aspects of cardiac tissue engineering. Am. J. Physiol Heart Circ Physiol. 303, H133-H143 (2012).
- Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317, 1366-1370 (2007).
- Li, F., Li, B., Wang, Q. M., Wang, J. H. Cell shape regulates collagen type I expression in human tendon fibroblasts. Cell Motil. Cytoskeleton. 65, 332-341 (2008).
- Sarkar, S., Dadhania, M., Rourke, P., Desai, T. A., Wong, J. Y. Vascular tissue engineering: microtextured scaffold templates to control organization of vascular smooth muscle cells and extracellular matrix. Acta Biomater. 1, 93-100 (2005).
- Isenberg, B. C., Wong, J. Y. Building structure into engineered tissues. Materials Today. 9, 54-60 (2006).
- Athanasiou, K. A., Zhu, C., Lanctot, D. R., Agrawal, C. M., Wang, X. Fundamentals of biomechanics in tissue engineering of bone. Tissue Eng. 6, 361-381 (2000).
- Feinberg, A. W., et al. Controlling the contractile strength of engineered cardiac muscle by hierarchal tissue architecture. Biomaterials. 33, 5732-5741 (2012).
- Black, L. D., Meyers, J. D., Weinbaum, J. S., Shvelidze, Y. A., Tranquillo, R. T. Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification. Tissue Eng. Part A. 15, 3099-3108 (2009).
- Kim, D. H., et al. Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 565-570 (2010).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur. Cell Mater. 18, 1-14 (2009).
- Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple approach to micropattern cells on common culture substrates by tuning substrate wettability. Tissue Eng. 10, 865-872 (2004).
- Leu, M., Ehler, E., Perriard, J. C. Characterisation of postnatal growth of the murine heart. Anat. Embryol. (Berl). 204, 217-224 (2001).
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J. Mol. Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Porrello, E. R., et al. Heritable pathologic cardiac hypertrophy in adulthood is preceded by neonatal cardiac growth restriction. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 296, 672-680 (2009).
- Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285, H2355-H2363 (2003).
- Ohler, A., et al. Two-photon laser scanning microscopy of the transverse-axial tubule system in ventricular cardiomyocytes from failing and non-failing human hearts. Cardiol. Res. Pract. 2009, 802373 (2009).
- Takahashi, H., Nakayama, M., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Anisotropic cell sheets for constructing three-dimensional tissue with well-organized cell orientation. Biomaterials. 32, 8830-8838 (2011).
- Williams, C., Xie, A. W., Yamato, M., Okano, T., Wong, J. Y. Stacking of aligned cell sheets for layer-by-layer control of complex tissue structure. Biomaterials. 32, 5625-5632 (2011).
