Isolement, culture et caractérisation fonctionnelle des adultes Cardiomyoctyes souris

Résumé

Nous décrivons ici l'isolement de cardiomyoctyes de souris adultes en utilisant un système de perfusion de Langendorff. Les cellules résultantes sont des ions Ca2 + à tolérance de repos électriquement et peuvent être cultivées et transfectées avec l'adénovirus ou de lentivirus de manipuler l'expression génique. Leur fonctionnalité peut également être analysé en utilisant le système MMSYS et techniques de patch-clamp.

Résumé

L'utilisation des cardiomyocytes primaires (CMS) dans la culture a fourni un complément puissant pour des modèles murins de la maladie de coeur dans l'avancement de notre compréhension de la maladie de coeur. En particulier, la capacité à étudier l'homéostasie ionique, de la fonction de canal ionique, l'excitabilité cellulaire et le couplage excitation-contraction et leurs altérations dans des conditions pathologiques et par des mutations pathogènes ont conduit à des avancées importantes au niveau des maladies cardiaques. En outre, l'absence d'une ligne suffisante de cellules immortalisées à imiter les adultes GC, et les limites de néonatale CM (qui n'ont pas beaucoup de la caractéristique de la biomécanique structurale et fonctionnelle des adultes MC) dans la culture ont entravé notre compréhension de l'interaction complexe entre les voies de signalisation, les canaux ioniques et les propriétés contractiles du coeur adulte renforcer l'importance d'étudier adultes cardiomyocytes isolés. Ici, nous présentons des procédés pour l'isolement, la culture, la manipulation de l'expression de gène par adenovirus expreprotéines sseD et analyse fonctionnelle ultérieure de cardiomyocytes de la souris adulte. L'utilisation de ces techniques permettra de développer une approche mécanistique dans les voies de régulation de l'excitabilité cellulaire, Ca ^{2 +} dynamique et la contractilité de signalisation et de fournir une caractérisation beaucoup plus physiologiquement pertinents de maladies cardio-vasculaires.

Introduction

Des modèles murins de maladie cardio-vasculaire ont servi d'outils efficaces pour élucider les mécanismes de la maladie ^1,2 fondamentales, ainsi que pour l'identification de cibles thérapeutiques potentielles ^1,3. En particulier, l'utilisation des deux modèles murins de maladies cardiaques acquises (tels que la pression de surcharge) et ^4,5 modèles de souris transgéniques ont fait progresser notre compréhension de la maladie cardiaque ^6-8. L'utilisation de techniques de culture de cellules à étudier cascades de signalisation ^3,9,10 et modifications dans les protéines individuelles qui sous-tendent....

Protocole

Une. Cardiomyocytes Isolation

Matériaux (Figure 1)

Microdissecting forceps
Pince de tissus
Pinces hémostatiques délicates
Pinces hémostatiques
Microdissecting, en dents de scie, pinces courbes
Ciseaux d'exploitation, droit
Ciseaux d'exploitation, courbe
15 ml des tubes Falcon (5)
60 mm boîte de Petri
Phosphate Buffered Saline (PBS)
Nylon Mesh - taille des pores 400 pm
Petit entonnoir
Enduit de cire, tressé de soie 4-0, 19 mm, 7-10 cm de long
Aiguille hypodermique non, extrémité émoussée, 24 G ou de....

Résultats

L'isolement des résultats cardiomyoctyes adultes dans des cellules en forme de baguette, striées, et quiescentes (pas spontanément battant) (Figure 5A). Les cellules mortes seront look arrondi et aucun stries seront présents. Cellules au repos peuvent être cultivées et transfectées avec l'adénovirus de manipuler l'expression des gènes (figures 5B et 5C). Après 24 heures de culture, la morphologie des cellules vivantes ne change pas, ils sont encore Ca ^2.......

Discussion

Dans ce rapport, nous avons décrit les techniques nécessaires pour permettre l'isolement et la culture des adultes CM du coeur de la souris. Notre technique permet une étude subséquente de la fonction et de l'excitabilité CM utilisant les procédés décrits ci-dessus. Le paramètre critique pour l'étude de la fonctionnalité des adultes MC est la santé et la qualité de l'isolement CM. Comme décrit ci-dessus, nos techniques permettent un rendement élevé de cellules fonctionnelles qui se prêtent à une manipula.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Chlorure	de sodium Sigma	S7653
Chlorure de potassium	Sigma	P9333
Chlorure de magnésium	Sigma	M8266
HEPES	Sigma	H3375
Phosphate de sodium monobasique	Sigma	S8282
D-glucose minimum	Sigma	G8270
Taurine	Sigma	T0625
2,3-Butanedione Monxime	Sigma	B0752
Collagénase B	Roche Applied Science	11088807001
Collagénase D	Roche Applied Science	11088858001
Protéase XIV de Streptomyces griseus	Sigma	P5147
Albumine de sérum bovin	Sigma	A2153
Chlorure de calcium	Sigma	C8106
Milieux essentiels minimaux	Sigma	51411C
Solution d’albumine à partir de sérum bovin	Sigma	A8412
L-glutamine	Sigma	G3126
Pénicilline-streptomycine	Sigma	P4333
Milieu insuline-transfertrine-sélénite sodique supplément	Sigma	I1884
Chlorure de césium	Sigma	289329
Glutamate	Sigma	G3291
Adénosine 5'-triphosphate sel de magnésium	Sigma	A9187
Éthylène glycol-bis(2-amin– ; thylether)-N,N,N',N'-acide tétraacétique	Sigma	E3889
Solution d’hydroxyde de césium	Sigma	232041
Solution d’hydroxyde de tétraéthylammonium	Sigma	86643
OptiVisor Verre optique Visière binoculaire	Dohegan Optical Company Inc.	N/A
Pince à tissus, 5,5 », 1x2 dents	Roboz Scientific	RS-8164
Pince Moloney - 4,5 » (11,5 cm) de long, légère courbure, dentelée	Roboz Scientific	RS-8254
Dumont #3 Forceps, Dumostar, taille de la pointe 0,17 x 0,10 mm	Roboz Scientific	RS-4966
Packer Moustique Pince 5 » Droite Plate	Roboz Scientific	RS-7114
Micro Ciseaux de Dissection 4.5 » Courbé Sharp/Sharp	Roboz Scientific	RS-5917
Micro Ciseaux de Dissection 3.5 » Straight Sharp/Sharp20mm	Roboz Scientific	RS-5907