Den seneste udvikling i neurovidenskab værktøjer, som kombinerer genetik og optik, betegnes "optogenetics", muliggør kontrol over neurale kredsløb aktivitet med et hidtil uset niveau af rumlige og tidsmæssige opløsning. Her giver vi en protokol for integration in vivo-optagelse med optogenetic manipulation af genetisk definerede delmængder af præfrontale cortex og subicular pyramideneuroner.
Optogenetic metoder er opstået som et effektivt værktøj til at belyse neurale kredsløb aktivitet bag et bredt sæt af adfærd på tværs af en bred vifte af arter. Optogenetic værktøjer mikrobiel oprindelse består af lysfølsomme membranproteiner, der er i stand til at aktivere (f.eks channelrhodopsin-2, ChR2) eller stilhed (f.eks halorhodopsin, NpHR) neurale aktivitet ingenetically definerede celletyper end adfærdsrelevante tidsskalaer. Vi først vise en enkel fremgangsmåde for adeno-associeret virus-medieret levering af ChR2 og NpHR transgener til den dorsale subiculum og prelimbic region af den præfrontale cortex hos rotter. Fordi ChR2 og NpHR genetisk målrettes, vi beskriver anvendelsen af denne teknologi til at styre den elektriske aktivitet af specifikke populationer af neuroner (dvs. pyramideformede neuroner) indlejret i heterogen væv med høj tidsmæssig præcision. Vi beskriver heri hardware, brugerdefinerede softwarebrugergrænsefladen, og procedurer, der giver mulighed for simultan lys levering og elektrisk optagelse fra transducerede pyramideneuroner i en bedøvet in vivo forberedelse. Disse lys-reagerende værktøjer giver mulighed for at identificere de kausale bidrag fra forskellige celletyper til informationsbehandling og adfærd.
Evnen til at aktivere eller tavshed en specifik celletype i et neuralt kredsløb i et tidsmæssigt præcis måde er afgørende for at forstå, hvordan neurale kredsløb behandle forskellige typer af information underliggende følelser og kognition. Eksperimentel kontrol over intakt neurale aktivitet har ansat loss-/gain-of-function værktøjer (f.eks elektrisk stimulering, farmakologisk modulation, læsion), som ikke giver den nødvendige selektivt til styring specifikke populationer af neuroner, enten på en tidsmæssig eller rumlig skala. Direkte tage disse teknologiske udfordringer, har udviklingen og anvendelsen af genetisk kodetegn lysfølsomme værktøjer aktiverede neuroforskere til at kontrollere den elektriske aktivitet i udvalgte celletyper under veldefinerede adfærdsmæssige begivenheder. Mange af disse lysfølsomme proteiner er af mikrobiel oprindelse med lys-gatede kation kanal, channelrhodopsin-2 (ChR2) 1, og lys-drevne chlorid pumpe, halorhodopsin (NpHR) 2,3, i udbredt brug.
En stor fordel ved optogenetics er evnen til genetisk at målrette specifikke cellepopulationer i heterogene områder af hjernen, og teknikken er blevet anvendt med succes til en række model-organismer (hvirvelløse dyr til humane primater) 4-6. Mange optogenetic transgene dyr er blevet genereret og er kommercielt tilgængelige 7,8 dog oprettelse transgene linier kan være arbejdskrævende og uoverkommelig. Her beskriver vi en protokol for viralt medieret levering af ChR2 og NpHR gener under CaMKIIα promotor i rotte prelimbic cortex og dorsal subiculum hjælp af en rekombinant adeno-associeret virus (AAV) vektor. Inden forebrain, CaMKIIα udtryk er eksklusivt til glutamaterge pyramideneuroner 9. AAV er almindeligt anvendt til grundforskning på grund af sin relativt let produktion og manglende patogenicitet, samt den stærke og Persistent transgen udtryk, der er opnået med disse vektorer 10. Derudover har vi skitsere de skridt og hardware til simultan lys levering og optagelse i bedøvede head-faste rotter.
En bred vifte af teknikker er til rådighed for genetisk målretning mikrobielle opsin gener til diskrete områder af hjernen hos gnavere. Viral genlevering tilvejebringer en relativt billig og hurtig metode til at mediere ChR2 og NpHR udtryk med celletype-specificitet. AAV vektor systemer er et fælles valg til brug i optogenetic eksperimenter på grund af høje produktionsomkostninger titre, der forbliver stabil under opbevaring, dens mangel på patogenicitet og dens evne til at producere langsigtede genekspression 10. Mange af opsin konstruktioner med celletype-specifikke promotorer, er kommercielt tilgængelige i en række forskellige AAV-serotyper fra vektor kerne, såsom University of Pennsylvania ( http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore ) eller University of North Carolina i Chapel Hill ( http://genetherapy.unc.edu ). En ulempe AAV teknologi erbegrænset emballage kapacitet (~ 4,7 kb), som lægger en begrænsning af transgen kassette størrelse, der kan bruges til at målrette celle-specifikke. Som et alternativ, lentivirale vektorer, som har en større emballage kapacitet, er i stand til at rumme opsin målrettet under kontrol af større promotorsekvenser.
Brugen af en optrode tillader pålidelig detektion af elektrofysiologiske signaler i kombination med timeligt-præcise lys levering. Som beskrevet ovenfor, er imidlertid behov for tilstrækkelig omhu i sin opbygning. Da det kløvede optiske fiber er skrøbelige, kan binde suturtråd for stramt forårsage fiberen til at knække. Selvom optrode kan anvendes til flere optagelser, skal elektroden og optiske fibre skal renses (eller manuelt spaltes i tilfælde af den optiske fiber nøgne ende) før indsættelse, fordi impedansen af elektroden og kvalitet af den leverede lys vil forringe med gentagen brug.
Under electrophysiological optagelser er det vigtigt, at optrode fremføres langsomt. Den optrode anvendes her har cirka 350 um tykkelse (wolframelektroden: 125 m; kerne optisk fiber: 200 um) og sænke det hurtigt kan føre til flytning af hjernevæv. Light-inducerede artefakter også kunne betragtes med særlig indspilning og lys levering set-ups 11-12. Selvom vi fandt ingen lysinduceret artefakt i vores eksperimentelle tilstand, kan optagelser uden den transducerede hjerneområde potentielt anvendes som en kontrol for lette artefakter. En anden overvejelse under optagelsen er for at observere ændringer i ChR2-eller NpHR-udtrykkende neuroner, især for lange varighed optagelser den krævede lysintensitet. Stærk laser intensitet og lang laserbelysning kan resultere i skader væv og / eller et nedsat respons på efterfølgende leveret lys 12-13. For adfærdsmæssige eksperimenter der kræves anvendelse af en kontrol viral vektor for LØSNINGg nogen effekt på grund af varme, der leveres fra fiberen. For mange af de kommercielt tilgængelige optogenetic konstruktioner der er komplementære kontrol konstruktioner, hvor opsin gensekvens er blevet fjernet.
Det skal bemærkes, at manipuleret ChR2 varianter med forbedrede egenskaber og kinetik er blevet udviklet sammen med andre lyddæmpningssystemer opsiner, der kan være bedre egnet til visse forsoeg spørgsmål 14-15. For eksempel kan en ny ChR2 variant er etableret via målrettet mutagenese, betegnes "Cheta" kan drive high-fidelity neuronal spiking ved frekvenser (op til mindst 200 Hz) over det oprindelige ChR2 14.
Kombinationen af in vivo lys levering og samtidig optagelse af neuronale reaktioner er et afgørende skridt i etableringen af årsagssammenhænge mellem mønstrede aktivitet i genetisk målrettede cellepopulationer og tilsvarende tid-låst adfærdsmæssige begivenheder. Procedurerne og hardware skitseret her giver en enkel tilgang til gennemførelsen optogenetics for in vivo head-faste optagelser i gnavere.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Institute on Drug Abuse (Nida) tilskud R01 DA24040 (DCC), University of Colorado Innovative Seed Grant (DCC), og Nida uddannelse tilskud T32 DA017637 (MVB).
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 μl |
Removable Needle | Hamilton | 7803-03 | 31 gauge, beveled tip |
Microinjector Pump | World Precision Instruments | UMP3 | |
Pump Controller | World Precision Instruments | SYS-MICRO4 | |
Silicone Oil | Alfa Aesar | A12728 | |
Laser Protective Eyeware | Kentek | KMT-4501 | |
Multimode Optical Fiber | Thorlabs | BFL37-200 | 200 μm diameter core, 0.37 NA |
Fiber Stripping Tool | Thorlabs | T12S21 | for 200 μm diameter core multimode fiber |
Optical Power Meter | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | |
Photodetector | Newport | 818-SL/DB | |
Blue Laser (445-473 nm, 100-200 mW) | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | coupled to a 200 μm multimode fiber with FC/PC adapter |
Green Laser (532 nm, 100-200 mW) | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | coupled to a 200 μm multimode fiber with FC/PC adapter |
Tungsten/Fiber Optrode | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | Lumitrode |
Glass Capillary Tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | |
Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MO-22 | |
Amplifier | Kation Scientific | ExAmp-20K | |
Data Acquistion Device | National Instruments | NI USB-6009 | |
Rodent Head Restraint for Recording | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | |
Small Animal Stereotaxic Unit | David Kopf Instruments | Model 963 |