Infections traitables avec des cellules de mammifères Protozoaire amorcées bactéries

Summary

Cette technique fournit une méthode pour récolter, normaliser et quantifier la croissance intracellulaire des bactéries pathogènes qui sont pré-cultivées dans les cellules hôtes naturels protozoaires avant infections de cellules de mammifères. Cette méthode peut être modifiée pour accueillir une grande variété de cellules hôtes pour la phase d'amorçage, ainsi que les types de cellules cibles.

Abstract

De nombreux agents pathogènes bactériens intracellulaires utiliser des protozoaires d'eau douce comme un réservoir naturel de la prolifération dans l'environnement. Legionella pneumophila, l'agent causal de la légionellose pneumonie, gagne un avantage sur les bactéries pathogènes cultivés in vitro lors de la première récolte de cellules de protozoaires avant l'infection des macrophages de mammifères. Ceci suggère que les facteurs de virulence importants peuvent ne pas être correctement exprimée de vitro. Nous avons développé un système souple pour l'amorçage L. pneumophila par son naturel protozoaire hôte Acanthamoeba castellanii avant l'infection de cellules de mammifères. La contribution d'un facteur de virulence peuvent être examinés en comparant la croissance intracellulaire d'une souche mutante de bactérie de type sauvage après l'amorçage protozoaire. Exprimant la GFP de type sauvage et mutant L. souches pneumophila sont utilisés pour infecter des monocouches de protozoaires dans une étape d'amorçage et a permis de franchir des étapes tardives de la croissance intracellulaire. Bactéries fluorescentes sont ensuite récoltées à partir de ces cellules infectées et normalisée par spectrophotométrie pour générer des nombres comparables de bactéries pour une infection ultérieure par les macrophages des mammifères. Pour la quantification, des bactéries vivantes sont surveillés après l'infection en utilisant la microscopie par fluorescence, cytométrie en flux, et par placage colonie. Cette technique met en évidence et repose sur la contribution de l'expression des gènes de la cellule hôte dépendant en imitant l'environnement qui seraient rencontrées dans un parcours d'acquisition naturelle. Cette approche peut être modifié pour tenir compte de toute bactérie qui utilise un hôte intermédiaire comme un moyen d'obtenir un avantage pathogène.

Introduction

De nombreux agents pathogènes bactériens ont adopté des stratégies généralisées pour exploiter les cellules hôtes pour la survie et la reproduction dans un compartiment intracellulaire. Dans de nombreux cas, les mécanismes pathogéniques sont similaires entre les protozoaires et les métazoaires cellules. Cependant, ces deux micro sont très différents et peuvent aboutir à l'expression différentielle des facteurs de virulence ^1-4. La légionellose bactérie Legionella pneumophila est ubiquitaire associés à des environnements d'eau douce dans le monde ^5. Surtout, L. pneumophila cultivé dans des cellules de protozoaires avant l'infection des monocytes humains obtenir un avantage pathogène, ce qui indique que les profils d'expression des gènes globales de la bactérie sortant d'une cellule de protozoaire est différente de celle de l'organisme cultivé in vitro en ^6-8. Dans la nature, les amibes d'eau douce constituent des nutriments riches limites pour l'amplification rapide d'une bactérie envahissante. Acquisition humaines de L. pneumophila est le plus souvent attribuée à l'inhalation de gouttelettes d'eau contaminées qui contiennent la bactérie. Il est probable que ces gouttelettes port protozoaires associées aux cellules des bactéries; où les cellules de protozoaires sont plus résistants aux pratiques conventionnelles de traitement de l'eau ^9,10. L'infection de macrophages alvéolaires pulmonaires produit d'une manière presque identique au cycle de vie intracellulaire de la bactérie dans les cellules hôtes protozoaires ^11-13.

Afin de survivre et se reproduire dans les cellules eucaryotes, L. pneumophila utilise un système de sécrétion de type spécialisé IVb appelé Dot / Icm de livrer près de 300 «effecteurs des protéines dans le cytosol de la cellule hôte ^14-16. Ces protéines effectrices collectivement fonctionner pour renverser les processus cellulaires afin de générer un compartiment de réplication permissive pour la bactérie ^17,18. Suppressions dans l'un des 26 gènes qui composent le résultat transporteur Dot / Icm dans des souches défectueuses pour mult intracellulaireiplication ^19-23. Historiquement, la suppression des différents gènes codant pour effectrices rarement abouti à des souches atténuées pour la croissance intracellulaire. Ce phénomène a été attribué à plusieurs hypothèses incluant la fonction de redondance et des copies paralogues des effecteurs.

Certains facteurs de virulence ne sont exprimés dans le contexte de la croissance intracellulaire de la cellule hôte associée ^24. Nous avons rationalisé que si un effecteur particulier a été exprimé que dans le contexte de l'infection protozoaire, la contribution de l'effecteur ne pouvait pas être comparée à une souche de type sauvage quand les deux ont été cultivées in vitro. L. pneumophila transitions d'une réplication à une phase de transmission en ce début de phase stationnaire dans la culture ^25. Le phénotype commutation de phase représente l'épuisement des nutriments rencontrée lors de la croissance intracellulaire et est illustrée à travers l'ensemble de flagelles pour la mobilité ^26. Parce que L. pneumophila est plus invasive et virulent lorsqu'il est récolté à partir des cellules de protozoaires, nous avons cherché à développer un test qui plus fidèlement représenté l'état pathogène de la bactérie quand il a rencontré macrophages de l'hôte.

À cette fin, nous avons développé un test d'amorçage protozoaire polyvalent qui peut accueillir n'importe quel hôte convenable pour les deux premiers (cellule d'amorçage) et deuxième infections scène (cellule cible). Le processus d'infection est traitable par l'utilisation de bactéries exprimant de manière stable la protéine fluorescente verte (GFP). Le modèle d'infection pour le protozoaire castellanii Acanthamoeba suit une méthodologie largement utilisée dans le domaine ^27. Pour l'étape d'amorçage, L. pneumophila souches sont cultivées de vitro jusqu'à la phase stationnaire dans des milieux liquides pour produire portant la mention «transmetteurs» bactéries (figure 1A). Les bactéries sont ensuite utilisés pour infecter des monocouches de A. castellanii pendant 18 heures pour atteindre un stade tardif du cycle de vie intracellulaire. Grandes vacuoles contiennenttion des bactéries peuvent être visualisés à ce point dans le temps en utilisant la microscopie à fluorescence (figure 1A). Cellules sont ensuite lysées protozoaires et bactéries récupérées à partir du lysat sont mesurées pour l'émission à 512 nm en utilisant un lecteur de plaque à fluorescence. La fluorescence est corrélée avec la densité optique de calculer la multiplicité de l'infection (MOI) pour l'infection de cellules cibles (figure 1, la courbe de corrélation *). H après l'invasion (T ₀₎ et 18 post-invasion (T _18), les cellules cibles sont quantifiés pour la fluorescence, ce qui représente des bactéries intracellulaires. La fluorescence peut être suivie en microscopie et cytométrie de flux, et les numérations viables peut être mesurée par placage colonie. Le test d'amorçage est toujours accompagnée par des infections de type sauvage avec L. pneumophila et une souche défectueux dans le système Dot / Icm de sécrétion de type IV (Δ DOTA) (figure 1A). Cela permet surtout de contrôle interne pour les comparaisons directes entre un type sauvagend des souches isogéniques mutantes utilisées dans le processus d'infection. L'inclusion de la souche virulente Δ Dota pendant la phase d'amorçage fixe un seuil pour l'observation des phénotypes de croissance atténués associés à isogéniques souches mutantes qui sont cultivées de vitro.

Protocol

1. Préparation des cultures de Legionella pneumophila pour les infections phase d'amorçage Transformer tout L. pneumophila souches utilisées dans l'essai avec le plasmide pAM239, codant pour un isopropyle β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) inductible protéine fluorescente verte (GFP) 28. Strie sur les souches bactériennes de fer et de la cystéine complétée N-(2-acétamido)-2-aminoéthanesulfonique (ACES) tamponné gélose à l'extrait de levur…

Representative Results

Un résultat typique pour le processus d'infection ensemble est présenté dans la figure 1. Vivez micrographies de fluorescence de cellules représentant des monocouches de A.castellanii infectées par le type sauvage L. pneumophila pendant la phase d'amorçage est illustré à la figure 1A. Une mesure réussie de l'étape d'amorçage conduirait à une population d'environ 90% des cellules hôtes contenant de grandes vacuoles peuplées par des bact…

Discussion

L'expression du gène bactérien est étroitement contrôlée par une combinaison de la progression du cycle de vie et en réponse à des signaux du micro-environnement environnant. Vacuolaires pathogènes comme L. pneumophila répondre à une multitude de dérivés de cellules hôtes indices quand compartimenté dans un phagosome. Comme un résultat collectif de l'épuisement des nutriments dans la cellule hôte, la bactérie compense en exprimant les facteurs nécessaires à une bonne diffusion dans u…

Materials

			Reagent
chloramphenicol	Fisher Scientific	BP904-100	antibiotic
IPTG	Fisher Scientific	BP1755-10
ACES	Sigma	A9758-1KG	media component
ATCC medium: 712 PYG	ATCC		growth media for protozoans
1X PBS	Fisher Scientific	SH30256FS	phosphate buffered saline
activated charcoal	Fisher Scientific	C272-212	media component
yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500	media component
peptone	BD Diagnostics	211677	media component
agar	Fisher Scientific	BP1423-2	media component
L-cysteine, 99%+	Acros organics	173601000	media supplement
Ferric nitrate nonahydrate	Fisher Scientific	I110-100	media supplement
			Equipment
EVOS fl	AMG	EVOS fl	fluorescence microscope
Smart Spec Plus	Bio-Rad	170-2525	spectrophotometer
5810 R centrifuge	Eppendorf	22627023	bench top centrifuge
Repeater plus	Eppendorf	22230201	repeating pipette
SpectraMax Gemini EM	Molecular Devices		microplate reader
Softmax Pro 5.3	Molecular Devices	0200-310	microplate reader software
5424 microfuge	Eppendorf	22620401	table top microcentrifuge
Fast-release pipette pump II	Scienceware	379111010	pipette aid
FACS Calibur	BD Bioscience		flow cytometer
FlowJo 7.6.1	FlowJo	license	flow cytometery software
15 ml tube	BD Falcon	352096	polypropylene conical tube
1.6 ml microfuge tube	Neptune	3745.X	microcentrifuge tubes