Spak däggdjurscellinjer Infektioner med protozo-primade Bakterier
Summary
Denna teknik ger en metod för att skörda, normalisera och kvantifiera intracellulär tillväxt av bakteriella patogener som är förinställda odlas i naturliga celler protozo värdceller före infektioner av däggdjursceller. Denna metod kan modifieras för att rymma en mängd olika värdceller för den primande etappen liksom mål celltyper.
Abstract
Många intracellulära bakteriella patogener använder sötvatten protozoer som en naturlig reservoar för spridning i miljön. Legionella pneumophila, det orsakande medlet av legionärssjuka lunginflammation, får en patogen fördel över in vitro odlade bakterier när de först skördade från protozoiska celler före infektion av däggdjur makrofager. Detta tyder på att viktiga virulensfaktorer inte riktigt uttryckas in vitro. Vi har utvecklat en lätthanterlig för grundning L. pneumophila genom sin naturliga värd protozo Acanthamoeba castellanii före däggdjursceller infektion. Bidraget från varje virulensfaktorn kan undersökas genom att jämföra intracellulär tillväxt av en mutant stam av vildtyp bakterier efter protozo grundning. GFP-uttryckande vildtyp och mutant L. pneumophila stammar används för att infektera monoskikt protozoiska i en primande steg och får uppnå sena stadier av intracellulär tillväxt. Fluorescerande bakterier skördas sedan från dessa infekterade celler och normaliserades genom spektrofotometri för att generera motsvarande antal bakterier för en efterföljande infektion i däggdjur makrofager. För kvantifiering, är levande bakterier övervakas efter infektion med användning av fluorescensmikroskopi, flödescytometri, och koloni plätering. Denna teknik belyser och förlitar sig på bidrag värdcellen-beroende genuttryck genom att härma miljön som skulle uppstå i en naturlig förvärv rutt. Detta tillvägagångssätt kan modifieras för att rymma varje bakterie som använder en mellanhand värd som ett medel för att få en patogen fördel.
Introduction
Talrika bakteriella patogener har anpassat generaliserade strategier för att utnyttja värdceller för överlevnad och replikering i en intracellulär avdelning. I många fall, patogena mekanismer lika mellan protozoer och metazoiska celler. Dessa två mikromiljöer är mycket olika och kan resultera i differentiellt uttryck av virulensfaktorer 1-4. Den legionärssjuka bakterien Legionella pneumophila är överallt förknippad med sötvattensmiljöer över hela världen 5. Viktigt är L. pneumophila odlades i protozoiska celler före infektion av humana monocyter få en patogen fördel, antyder att globala genuttrycksprofilerna av bakterien lämnar en protozo-cell är annorlunda än den hos in vitro odlade organismen 6-8. I naturen, sötvatten amöbor ger näringsrika gränserna för snabb förstärkning av en invaderande bakterien. Mänskliga förvärv av L. pneumophila oftast tillskrivs inandning av förorenade vattendroppar som innehåller bakterien. Det är troligt att dessa droppar harbor protozo cellassocierade bakterier, där protozoiska celler är mer resistenta mot konventionella metoder vattenrening 9,10. Infektion av lung alveolära makrofager fortskrider på ett sätt som nästan identisk med den intracellulära livscykel bakterien i protozo värdceller 11-13.
För att överleva och replikera i eukaryota celler, L. pneumophila använder en specialiserad typ IVb sekretionssystem benämnd Dot / ICM att leverera nästan 300 'effektor "proteiner in i cytosolen hos värdcellen 14-16. Dessa effektor proteiner fungerar tillsammans för att undergräva cellulära processer för att generera en replikering tillåtande fack för bakterien 17,18. Deletioner i någon av de 26 gener som utgör Dot / ICM transportör resultat i stammar defekta för intracellulär multiplication 19-23. Historiskt, resulterade deletion av enskilda effektor kodande gener sällan i stammar försvagade för intracellulär tillväxt. Detta fenomen har tillskrivits flera hypoteser, inklusive överflödig funktion och paraloga kopior av effektorer.
Vissa virulensfaktorer endast uttrycks i samband med värdcell-associerad intracellulär tillväxt 24. Vi rationaliseras att om en viss effektor uttrycktes endast i samband med protozo-infektion, då bidraget av effektorn inte kunde jämföras med en vildtyp stam när båda odlades in vitro. L. pneumophila övergångar från ett replikativt till en transmissiv fas när den kommer in stationär fas i kultur 25. Fasen byta fenotyp representerar näringsämnen utarmning påträffas under intracellulär tillväxt och exemplifieras genom montering av flageller för motilitet 26. Eftersom L. pneumophila är mer invasionenomfattande och virulenta när skördats från protozoer celler, försökte vi utveckla en analys som mer troget representerade patogena tillstånd av bakterien när den möter värd makrofager.
I detta syfte har vi utvecklat en mångsidig analys protozo grundning som kan rymma något lämpligt värd för både de första (priming-cell) och andra (målcellen) steg infektioner. Infektionsprocessen är lätthanterligt genom användning av bakterier som stabilt uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP). Infektionen modell för protozo Acanthamoeba castellanii följer en metod används ofta i fältet 27. För grundning steget, L. pneumophila stammar odlas in vitro till stationär fas i flytande media för att producera märkta "genomskinliga" bakterier (Figur 1A). Bakterier nästa för att infektera monoskikt av A. castellanii under 18 timmar för att uppnå ett sent skede av den intracellulära livscykeln. Stora vakuoler innehållerning bakterier kan visualiseras vid denna tidpunkt med fluorescensmikroskopi (figur 1A). Protozoiska celler lyseras sedan och bakterier som återvunnits från lysatet mäts för emission vid 512 nm med användning av en fluorescens-plattläsare. Fluorescens är korrelerad med optisk densitet för att beräkna mångfald-av-infektion (MOI) för infektion av målceller (Figur 1, * Korrelation Kurva). Efter invasionen (T 0) och 18 timmar efter invasionen (T 18), är målceller kvantifieras för fluorescens, representerande intracellulära bakterier. Fluorescens kan övervakas genom mikroskopi och flödescytometri, och bakterieräkning kan mätas genom koloni plätering. Den priming Analysen åtföljs alltid av infektioner med vildtyp L. pneumophila och en stam defekt i Dot / ICM typ IV sekretionssystem (Δ DOTA) (figur 1A). Detta ger allt den interna kontrollen för direkta jämförelser mellan vildtyp ennd eventuella isogena mutantstammar användes i infektionsprocessen. Införandet av avirulenta Δ DOTA stam under priming steget fastställer en tröskel för observation av försvagade tillväxten fenotyper associerade med isogena mutantstammar som odlas in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bakteriell genuttryck tätt kontrolleras genom en kombination av livscykeln progression och gensvar på signaler i den omgivande mikromiljön. Vakuolär patogener såsom L. pneumophila svarar på en mängd värd-cell-härledda signaler när uppdelade i en fagosomen. Som en kollektiv resultat av näringsämnen utmattning i värdcellen, kompenserar bakterien genom att uttrycka faktorer som krävs för en lyckad spridning till en efterföljande värdcell 25. L. pneumophila anpassade att effekti…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Craig Roy och Dr Dario Zamboni för att ge en mall för protozo cell infektioner. Vi tackar Dr Jagdeep Obhrai, Dr Georgiana Purdy, Dr Fred Heffron och Todd Wisner för utrustning och reagenser, Dr Lulu Cambronne för kritisk granskning av manuskriptet. Flödescytometri utfördes på OHSU flödescytometri delad resurs anläggning. Detta arbete stöddes delvis av ett anslag från medicinsk forskning Stiftelsen Oregon och en NIH bidrag R21 AI088275 (EDC).
Materials
| Reagent | |||
| chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | antibiotic |
| IPTG | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| ACES | Sigma | A9758-1KG | media component |
| ATCC medium: 712 PYG | ATCC | growth media for protozoans | |
| 1X PBS | Fisher Scientific | SH30256FS | phosphate buffered saline |
| activated charcoal | Fisher Scientific | C272-212 | media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | media component |
| peptone | BD Diagnostics | 211677 | media component |
| agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | media component |
| L-cysteine, 99%+ | Acros organics | 173601000 | media supplement |
| Ferric nitrate nonahydrate | Fisher Scientific | I110-100 | media supplement |
| Equipment | |||
| EVOS fl | AMG | EVOS fl | fluorescence microscope |
| Smart Spec Plus | Bio-Rad | 170-2525 | spectrophotometer |
| 5810 R centrifuge | Eppendorf | 22627023 | bench top centrifuge |
| Repeater plus | Eppendorf | 22230201 | repeating pipette |
| SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | microplate reader | |
| Softmax Pro 5.3 | Molecular Devices | 0200-310 | microplate reader software |
| 5424 microfuge | Eppendorf | 22620401 | table top microcentrifuge |
| Fast-release pipette pump II | Scienceware | 379111010 | pipette aid |
| FACS Calibur | BD Bioscience | flow cytometer | |
| FlowJo 7.6.1 | FlowJo | license | flow cytometery software |
| 15 ml tube | BD Falcon | 352096 | polypropylene conical tube |
| 1.6 ml microfuge tube | Neptune | 3745.X | microcentrifuge tubes |
References
- Mahan, M. J., Slauch, J. M., Mekalanos, J. J. Selection of bacterial virulence genes that are specifically induced in host tissues. Science. 259, 686-688 (1993).
- Mahan, M. J., et al. Antibiotic-based selection for bacterial genes that are specifically induced during infection of a host. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 669-673 (1995).
- Rankin, S., Isberg, R. R. Identification of Legionella pneumophila promoters regulated by the macrophage intracellular environment. Infect. Agents Dis. 2, 269-271 (1993).
- Rankin, S., Li, Z., Isberg, R. R. Macrophage-induced genes of Legionella pneumophila: protection from reactive intermediates and solute imbalance during intracellular growth. Infect. Immun. 70, 3637-3648 (2002).
- Fields, B. S. The molecular ecology of legionellae. Trends Microbiol. 4, 286-290 (1996).
- Cirillo, J. D., et al. Intracellular growth in Acanthamoeba castellanii affects monocyte entry mechanisms and enhances virulence of Legionella pneumophila. Infect. Immun. 67, 4427-4434 (1999).
- Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S. Growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii enhances invasion. Infect. Immun. 62, 3254-3261 (1994).
- Faucher, S. P., Mueller, C. A., Shuman, H. A. Legionella pneumophila Transcriptome during Intracellular Multiplication in Human Macrophages. Front Microbiol. 2, 60 (2011).
- Kilvington, S., Price, J. Survival of Legionella pneumophila within cysts of Acanthamoeba polyphaga following chlorine exposure. J. Appl. Bacteriol. 68, 519-525 (1990).
- King, C. H., Shotts, E. B., Wooley, R. E., Porter, K. G. Survival of coliforms and bacterial pathogens within protozoa during chlorination. Appl. Environ. Microbiol. 54, 3023-3033 (1988).
- Horwitz, M. A. Formation of a novel phagosome by the Legionnaires’ disease bacterium (Legionella pneumophila) in human monocytes. J. Exp. Med. 158, 1319-1331 (1983).
- Horwitz, M. A. Phagocytosis of the Legionnaires’ disease bacterium (Legionella pneumophila) occurs by a novel mechanism: engulfment within a pseudopod coil. Cell. 36, 27-33 (1984).
- Horwitz, M. A., Silverstein, S. C. Legionnaires’ disease bacterium (Legionella pneumophila) multiples intracellularly in human monocytes. J. Clin. Invest. 66, 441-450 (1980).
- Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLoS Pathog. 5, e1000508 (2009).
- Zhu, W., et al. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS One. 6, e17638 .
- Nagai, H., Kubori, T. Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria. Front Microbiol. 2, 136 (2011).
- Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).
- Shin, S., Roy, C. R. Host cell processes that influence the intracellular survival of Legionella pneumophila. Cell Microbiol. 10, 1209-1220 (2008).
- Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 7, 7-19 (1993).
- Marra, A., Blander, S. J., Horwitz, M. A., Shuman, H. A. Identification of a Legionella pneumophila locus required for intracellular multiplication in human macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 9607-9611 (1992).
- Segal, G., Purcell, M., Shuman, H. A. Host cell killing and bacterial conjugation require overlapping sets of genes within a 22-kb region of the Legionella pneumophila genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1669-1674 (1998).
- Segal, G., Shuman, H. A. Characterization of a new region required for macrophage killing by Legionella pneumophila. Infect Immun. 65, 5057-5066 (1997).
- Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
- Haghjoo, E., Galan, J. E. Identification of a transcriptional regulator that controls intracellular gene expression in Salmonella Typhi. Mol. Microbiol. 64, 1549-1561 (2007).
- Molofsky, A. B., Swanson, M. S. Differentiate to thrive: lessons from the Legionella pneumophila life cycle. Mol. Microbiol. 53, 29-40 (2004).
- Hammer, B. K., Tateda, E. S., Swanson, M. S. A two-component regulator induces the transmission phenotype of stationary-phase Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 44, 107-118 (2002).
- Ninio, S., Zuckman-Cholon, D. M., Cambronne, E. D., Roy, C. R. The Legionella IcmS-IcmW protein complex is important for Dot/Icm-mediated protein translocation. Mol. Microbiol. 55, 912-926 (2005).
- Neild, A. L., Roy, C. R. Legionella reveal dendritic cell functions that facilitate selection of antigens for MHC class II presentation. Immunity. 18, 813-823 (2003).
- Molmeret, M., Horn, M., Wagner, M., Santic, M., Abu Kwaik, Y. Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens. Appl. Environ. Microbiol. 71, 10-1128 (2005).
- Huws, S. A., Smith, A. W., Enright, M. C., Wood, P. J., Brown, M. R. Amoebae promote persistence of epidemic strains of MRSA. Environ. Microbiol. 8, 1130-1133 (2006).
