איתור סלקטיבי של סיבי עצב שמיעה בVestibulocochlear העוברי העופות
Summary
כאן אנו מתארים טכניקת microdissection אחרי הזרקת הצבע פלואורסצנטי לגנגליון אקוסטית של עוברי חומוס מוקדמים לאיתור סלקטיבי של סיבים שמיעתיים האקסון בעצבים והמוח האחורי.
Abstract
האפרוח העוברי הוא מודל שימוש נרחב למחקר של תחזיות תא גנגליון היקפיות ומרכזיות. במערכת השמיעה, תיוג סלקטיבית של אקסונים שמיעתיים בתוך עצב גולגולת המחנה השמיני היה לשפר את המחקר של התפתחות מעגל שמיעתי המרכזית. גישה זו מאתגרת, כי אברי חישה מרובים של האוזן הפנימית לתרום לעצב המחנה השמיני 1. יתרה מזאת, סמנים שמבדילים אמין שמיעתי לעומת קבוצות שיווי משקל של אקסונים בתוך עצב המחנה השמיני עופות עדיין לא זוהו. מסלולים שמיעתיים ושיווי משקל לא ניתן להבדיל באופן פונקציונלי בעוברים מוקדמים, כתגובה חושית מעוררת אינן נוכחת לפני המעגלים נוצרים. אקסונים עצב מחנה שמיניים מרכזי מקרינים אותרו בחלק מהמחקרים, אבל תיוג האקסון השמיעתי לווה על ידי תיוג ממרכיבי עצב מחנה שמיני אחרים 2,3. כאן, אנו מתארים שיטה למעקב האנטרוגרד מגנגליון אקוסטי לסלקטיבי Labeאקסונים שמיעתיים הליטר בתוך המחנה השמיני העצבים המתפתחים. ראשית, לאחר נתיחה חלקית של אזור cephalic הקדמי של עובר אפרוח 8-יום שקוע בנוזל השדרתי מלאכותי חומץ, את צינור השבלול מזוהה על ידי ציוני דרך אנטומיים. בשלב בא, micropipette זכוכית משך קנס ממוקם להזריק כמות קטנה של rhodamine dextran אמין לאזור העמוק הדביק וצמוד בו תאי גנגליון אקוסטיים נמצאים. בתוך שלושים דקות לאחר ההזרקה, אקסונים שמיעתיים הם נעוצים מרכזיים למוח האחורי, ומאוחר יותר ניתן דמיינו לאחר הכנה היסטולוגית. שיטה זו מספקת כלים שימושיים למחקרים התפתחותיים של ציוד היקפי להיווצרות מעגל שמיעתי מרכזית.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקרים על ההתפתחות המוקדמת של עצב המחנה השמיני היו מוגבלים בחלקו בשל הקושי בזיהוי האקסונים עובריים הנובעים מגרעינים מובחנים מרובים. מספר מחקרים בחנו את האותות המולקולריים המנחים שמיעתי ותא חושי שיווי משקל וגורל תאי הגנגליון במהלך ההתפתחות המוקדמת, אבל 5,11,12 ה?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לד"ר קנדיס היישה להצעות וסיוע בטכניקות הדמיה ודוריס ד"ר וו במומחיות על האנטומיה של אוזן פנימית אפרוח במהלך ההתפתחות עוברת מוקדם. עבודה זו נתמכה על ידי NSF IOS-0642346, NIH-T32 DC010775, NIH-T32 GM008620, NIH R01-DC010796, וDOE GAANN P200A120165.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene Weigh Dish | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
| Petri Dish, 35 X 10 mm | Fisher Scientific | 50820644 | Use to make silicone dissection dish |
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | World Precision Instruments | SYLG184 | Coat Petri to make dissection dish |
| Dissection Pins | Various | Holds embryo in place during dissection | |
| NaCL | Various | part of aCSF recipe | |
| KCl | Various | part of aCSF recipe | |
| KH2PO4 | Various | part of aCSF recipe | |
| NaHCO3 | Various | part of aCSF recipe | |
| Glucose | Various | part of aCSF recipe | |
| CaCl2 | Various | part of aCSF recipe | |
| MgSO4 | Various | part of aCSF recipe | |
| Container for aCSF. Suggest translucent wide-mouth Nalgene jar, 500 ml (16 oz) with lid. | CPLabSafety | QP-PLC-03717 | Drill hole opening in top of lid for glass bubling stem to penetrate liquid |
| Empty 5 ml glass vial or comparable transparent vial | American Pharmaceutical Partners, Inc | 6332300105 | Use during aCSF incubation to keep samples separate from each other and from the bubbling stream |
| Tank of carbogen (95%O2 / 5%CO2) connected by tubing to bubbler | Various | Attach by tubing to glass stem bubbler for infusion into aCSF | |
| Glass stem bubbler | Various | To infuse carbogen into aCSF | |
| Curved-tip forceps | World Precision Instruments | 501008 | To remove embryo head from egg |
| Two fine-tip forceps | World Precision Instruments | 501985 | For micro-dissection |
| 50 ml Beaker | various | ||
| Rhodamine Dextran Amine (RDA) | Invitrogen | various | Fluorescent axon tracer |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | ||
| Phosphate Buffered Saline, (1X PBS) | Various | Standard lab reagent | |
| Thin Wall Glass Capillaries, 1.2 OD, .9 ID 4″ (100 mm) length | World Precision Instruments | TW120F-4 | Load with RDA. Each capillary makes two glass micropipettes |
| Needle / Pipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | Settings used: Heat 16.4, Solenoid 2.2 |
| Picospritzer | Parker Instrumentation | various | Attach by fine tubing to glass micropipette |
| Micromanipulator | Narishige | various | |
| Dissection microscope with fluorescence | Various | ||
| 4% Paraformaldehyde | Various | Standard lab reagent | |
| anti-Neurofilament antibody, optional | Millipore | AB1991 | Follow histological protocol recommended by manufacturer |
| Cryostat and associated materials for sectioning | Leica | various | |
| Epifluorescent microscope for imaging | Zeiss, various |
References
- Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139, 245-257 (2012).
- Pflieger, J. F., Cabana, T. The vestibular primary afferents and the vestibulospinal projections in the developing and adult opossum, Monodelphis domestica. Anatomy and Embryology. 194, 75-88 (1996).
- Molea, D., Rubel, E. W. Timing and topography of nucleus magnocellularis innervation by the cochlear ganglion. The Journal of Comparative Neurology. 466, 577-591 (2003).
- Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of Comparative Neurology. 368, 620-630 (1996).
- Brigande, J. V., Kiernan, A. E., Gao, X., Iten, L. E., Fekete, D. M. Molecular genetics of pattern formation in the inner ear: do compartment boundaries play a role. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11700-11706 (1073).
- Bellairs, R., Osmond, M. . The atlas of chick development. , (2005).
- Manley, G. A., Haeseler, C., Brix, J. Innervation patterns and spontaneous activity of afferent fibres to the lagenar macula and apical basilar papilla of the chick’s cochlea. Hearing Research. 56, 211-226 (1991).
- Code, R. A. Efferent neurons to the macular lagena in the embryonic chick. Hearing Research. 82, 26-30 (1995).
- Maklad, A., Fritzsch, B. Development of vestibular afferent projections into the hindbrain and their central targets. Brain Research Bulletin. 60, 497-510 (2003).
- Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
- Satoh, T., Fekete, D. M. Lineage analysis of inner ear cells using genomic tags for clonal identification. Methods Mol. Biol. 493, 47-63 (2009).
- Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. The International Journal of Developmental Biology. 51, 521-533 (2007).
- Appler, J. M., Goodrich, L. V. Connecting the ear to the brain: Molecular mechanisms of auditory circuit assembly. Progress in Neurobiology. 93, 488-508 (2011).
- Bulankina, A. V., Moser, T. Neural circuit development in the mammalian cochlea. Physiology (Bethesda). 27, 100-112 (2012).
- Fekete, D. M., Campero, A. M. Axon guidance in the inner ear. The International Journal of Developmental Biology. 51, 549-556 (2007).
- Momose-Sato, Y., Glover, J. C., Sato, K. Development of functional synaptic connections in the auditory system visualized with optical recording: afferent-evoked activity is present from early stages. Journal of Neurophysiology. 96, 1949-1962 (2006).
- Marrs, G. S., Spirou, G. A. Embryonic assembly of auditory circuits: spiral ganglion and brainstem. The Journal of Physiology. 590, 2391-2408 (2012).
- Milo, M., et al. Genomic analysis of the function of the transcription factor gata3 during development of the mammalian inner ear. PloS One. 4, e7144 (2009).
- Fritzsch, B., Eberl, D. F., Beisel, K. W. The role of bHLH genes in ear development and evolution: revisiting a 10-year-old hypothesis. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67, 3089-3099 (2010).
- Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. Neurod1 regulates survival and formation of connections in mouse ear and brain. Cell and Tissue Research. 341, 95-110 (2010).
- Huang, E. J., et al. Brn3a is a transcriptional regulator of soma size, target field innervation and axon pathfinding of inner ear sensory neurons. Development. 128, 2421-2432 (2001).
- Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516, 507-518 (2009).
- Lu, C. C., Appler, J. M., Houseman, E. A., Goodrich, L. V. Developmental profiling of spiral ganglion neurons reveals insights into auditory circuit assembly. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 10903-10918 (2011).
