Selektive Tracing von Auditory Fibers im Avian Embryonale vestibulocochlearis
Summary
Hier beschreiben wir eine Technik, die von Mikrodissektion Fluoreszenzfarbstoff Injektion in den akustischen Ganglion frühen Hühnerembryonen zur selektiven Rückverfolgung von auditorischen Axon Fasern im Nerv und Rautenhirn gefolgt.
Abstract
Die embryonale Küken ist ein weit verbreitetes Modell für die Untersuchung der peripheren und zentralen Ganglienzellen Projektionen. Im auditorischen System würde selektive Markierung von auditiven Axone innerhalb des VIII. Hirnnerven verbessern das Studium der zentralen auditorischen Schaltungsentwicklung. Dieser Ansatz ist schwierig, weil mehrere Sinnesorgane des Innenohrs der VIII. Nerven 1 beitragen. Darüber hinaus haben Markern, die zuverlässig unterscheiden auditive gegenüber vestibulären Gruppen von Axonen innerhalb der Vogelgrippe VIII. Nerven noch nicht identifiziert werden. Auditive und vestibulären Wege nicht funktional in frühen Embryonen unterschieden werden, als sensorische hervorgerufenen Reaktionen nicht vorhanden sind, bevor die Schaltungen ausgebildet sind. Zentral vorstehenden VIII. Nervenaxone haben in einigen Studien verfolgt worden, aber auditiven Axon Markierung wurde durch Markierung von anderen VIII. Nerven Bauteile 2,3 begleitet. Hier beschreiben wir eine Methode zur anterograde Tracing von der akustischen ganglion selektiv label auditiven Axone innerhalb des sich entwickelnden VIII. Nerven. Erste, nach teilweiser Durchtrennung des vorderen Schädelbereich des 8-tägiger Hühnerembryos in sauerstoffhaltigen künstliche Zerebrospinalflüssigkeit eingetaucht wird der Kanal durch Cochlea anatomischen Landmarken identifiziert. Als Nächstes wird ein feiner gezogen Glasmikropipette positioniert, um eine kleine Menge an Rhodamin Dextran Amin in den Kanal und benachbart tiefen Bereich, wo die akustischen Ganglienzellen befinden injizieren. Innerhalb 30 Minuten nach der Injektion werden auditive Axone zentral in den Hinterhirn zurückverfolgt und können später visualisiert werden nach histologischen Vorbereitung. Diese Methode liefert ein nützliches Werkzeug für Entwicklungsstudien der peripheren zum zentralen auditorischen Schaltung Bildung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studien der frühen Entwicklung des VIII. Nerven wurden zum Teil wegen der Schwierigkeiten bei der Ermittlung embryonalen Axone aus mehreren verschiedenen Ganglien begrenzt. Mehrere Studien haben die molekularen Signale Führung auditorischen und vestibulären sensorischen Zellen und Ganglienzellen Schicksale während der frühen Entwicklung, 5,11,12 erforscht, aber die Prozesse, die die zentrale Innervation müssen noch bestimmt werden. Berichte von akustischen Ganglienzellen Projektionen beschreiben typisch…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Candace Hsieh für Anregungen und Unterstützung danken, mit bildgebenden Verfahren und Dr. Doris Wu für Kompetenz auf chick Innenohr Anatomie während der frühen Embryogenese. Diese Arbeit wurde von der NSF IOS-0642346, NIH T32-DC010775, NIH T32-GM008620, NIH R01-DC010796 und DOE GAANN P200A120165 unterstützt.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene Weigh Dish | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
| Petri Dish, 35 X 10 mm | Fisher Scientific | 50820644 | Use to make silicone dissection dish |
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | World Precision Instruments | SYLG184 | Coat Petri to make dissection dish |
| Dissection Pins | Various | Holds embryo in place during dissection | |
| NaCL | Various | part of aCSF recipe | |
| KCl | Various | part of aCSF recipe | |
| KH2PO4 | Various | part of aCSF recipe | |
| NaHCO3 | Various | part of aCSF recipe | |
| Glucose | Various | part of aCSF recipe | |
| CaCl2 | Various | part of aCSF recipe | |
| MgSO4 | Various | part of aCSF recipe | |
| Container for aCSF. Suggest translucent wide-mouth Nalgene jar, 500 ml (16 oz) with lid. | CPLabSafety | QP-PLC-03717 | Drill hole opening in top of lid for glass bubling stem to penetrate liquid |
| Empty 5 ml glass vial or comparable transparent vial | American Pharmaceutical Partners, Inc | 6332300105 | Use during aCSF incubation to keep samples separate from each other and from the bubbling stream |
| Tank of carbogen (95%O2 / 5%CO2) connected by tubing to bubbler | Various | Attach by tubing to glass stem bubbler for infusion into aCSF | |
| Glass stem bubbler | Various | To infuse carbogen into aCSF | |
| Curved-tip forceps | World Precision Instruments | 501008 | To remove embryo head from egg |
| Two fine-tip forceps | World Precision Instruments | 501985 | For micro-dissection |
| 50 ml Beaker | various | ||
| Rhodamine Dextran Amine (RDA) | Invitrogen | various | Fluorescent axon tracer |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | ||
| Phosphate Buffered Saline, (1X PBS) | Various | Standard lab reagent | |
| Thin Wall Glass Capillaries, 1.2 OD, .9 ID 4″ (100 mm) length | World Precision Instruments | TW120F-4 | Load with RDA. Each capillary makes two glass micropipettes |
| Needle / Pipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | Settings used: Heat 16.4, Solenoid 2.2 |
| Picospritzer | Parker Instrumentation | various | Attach by fine tubing to glass micropipette |
| Micromanipulator | Narishige | various | |
| Dissection microscope with fluorescence | Various | ||
| 4% Paraformaldehyde | Various | Standard lab reagent | |
| anti-Neurofilament antibody, optional | Millipore | AB1991 | Follow histological protocol recommended by manufacturer |
| Cryostat and associated materials for sectioning | Leica | various | |
| Epifluorescent microscope for imaging | Zeiss, various |
References
- Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139, 245-257 (2012).
- Pflieger, J. F., Cabana, T. The vestibular primary afferents and the vestibulospinal projections in the developing and adult opossum, Monodelphis domestica. Anatomy and Embryology. 194, 75-88 (1996).
- Molea, D., Rubel, E. W. Timing and topography of nucleus magnocellularis innervation by the cochlear ganglion. The Journal of Comparative Neurology. 466, 577-591 (2003).
- Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of Comparative Neurology. 368, 620-630 (1996).
- Brigande, J. V., Kiernan, A. E., Gao, X., Iten, L. E., Fekete, D. M. Molecular genetics of pattern formation in the inner ear: do compartment boundaries play a role. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11700-11706 (1073).
- Bellairs, R., Osmond, M. . The atlas of chick development. , (2005).
- Manley, G. A., Haeseler, C., Brix, J. Innervation patterns and spontaneous activity of afferent fibres to the lagenar macula and apical basilar papilla of the chick’s cochlea. Hearing Research. 56, 211-226 (1991).
- Code, R. A. Efferent neurons to the macular lagena in the embryonic chick. Hearing Research. 82, 26-30 (1995).
- Maklad, A., Fritzsch, B. Development of vestibular afferent projections into the hindbrain and their central targets. Brain Research Bulletin. 60, 497-510 (2003).
- Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
- Satoh, T., Fekete, D. M. Lineage analysis of inner ear cells using genomic tags for clonal identification. Methods Mol. Biol. 493, 47-63 (2009).
- Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. The International Journal of Developmental Biology. 51, 521-533 (2007).
- Appler, J. M., Goodrich, L. V. Connecting the ear to the brain: Molecular mechanisms of auditory circuit assembly. Progress in Neurobiology. 93, 488-508 (2011).
- Bulankina, A. V., Moser, T. Neural circuit development in the mammalian cochlea. Physiology (Bethesda). 27, 100-112 (2012).
- Fekete, D. M., Campero, A. M. Axon guidance in the inner ear. The International Journal of Developmental Biology. 51, 549-556 (2007).
- Momose-Sato, Y., Glover, J. C., Sato, K. Development of functional synaptic connections in the auditory system visualized with optical recording: afferent-evoked activity is present from early stages. Journal of Neurophysiology. 96, 1949-1962 (2006).
- Marrs, G. S., Spirou, G. A. Embryonic assembly of auditory circuits: spiral ganglion and brainstem. The Journal of Physiology. 590, 2391-2408 (2012).
- Milo, M., et al. Genomic analysis of the function of the transcription factor gata3 during development of the mammalian inner ear. PloS One. 4, e7144 (2009).
- Fritzsch, B., Eberl, D. F., Beisel, K. W. The role of bHLH genes in ear development and evolution: revisiting a 10-year-old hypothesis. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67, 3089-3099 (2010).
- Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. Neurod1 regulates survival and formation of connections in mouse ear and brain. Cell and Tissue Research. 341, 95-110 (2010).
- Huang, E. J., et al. Brn3a is a transcriptional regulator of soma size, target field innervation and axon pathfinding of inner ear sensory neurons. Development. 128, 2421-2432 (2001).
- Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516, 507-518 (2009).
- Lu, C. C., Appler, J. M., Houseman, E. A., Goodrich, L. V. Developmental profiling of spiral ganglion neurons reveals insights into auditory circuit assembly. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 10903-10918 (2011).
