L'analisi selettiva delle fibre uditive nel aviaria Nerve Embryonic vestibolococleare
Summary
Qui si descrive una tecnica di microdissezione seguito da iniezione di colorante fluorescente nel ganglio acustico di embrioni di pollo primi selettiva per rintracciare uditive fibre assoni nel nervo e rombencefalo.
Abstract
Il pulcino embrionale è un modello ampiamente utilizzato per lo studio delle proiezioni gangliari periferiche e centrali cellulari. Nel sistema uditivo, etichettatura selettiva degli assoni uditivi all'interno del nervo cranico VIII aumenterebbe lo studio dello sviluppo del circuito uditivo centrale. Questo approccio è impegnativo, perché di vari organi sensoriali dell'orecchio interno contribuiscono al nervo VIII 1. Inoltre, marcatori che distinguono affidabile uditivo rispetto vestibolari gruppi di assoni all'interno del nervo VIII aviaria devono ancora essere identificati. Vie uditive e vestibolari non si distinguono funzionalmente in embrioni precoci, come-sensoriali evocate risposte non sono presenti prima che i circuiti sono formati. Centrale sporgenti assoni dei nervi dell'VIII sono stati rintracciati in alcuni studi, ma uditivo etichettatura assone è stata accompagnata da etichettare dagli altri componenti del nervo dell'VIII 2,3. Qui, descriviamo un metodo per l'analisi anterograda dal ganglio acustico in modo selettivo labeassoni uditive l all'interno del nervo VIII in via di sviluppo. In primo luogo, dopo la dissezione parziale della regione anteriore cefalica di un 8 giorni di embrione di pollo immerso nel liquido cerebrospinale artificiale ossigenato, il condotto cocleare è identificato da punti di repere anatomici. Successivamente, una micropipetta di vetro sottile tirato è posizionata per iniettare una piccola quantità di rodamina destrano ammina nella regione di canale e adiacente profonda in cui si trovano le cellule gangliari acustici. Entro trenta minuti dopo l'iniezione, assoni uditive sono tracciate a livello centrale nel cervello posteriore e possono poi essere visualizzati a seguito della preparazione istologica. Questo metodo fornisce un utile strumento per gli studi di sviluppo della periferica alla formazione circuito centrale uditivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studi di sviluppo precoce del nervo VIII sono stati limitati, in parte a causa della difficoltà di identificare assoni embrionali derivanti da più gangli distinti. Diversi studi hanno esplorato i segnali molecolari che guidano uditivo e vestibolare delle cellule sensoriali e destini delle cellule ganglionari durante lo sviluppo iniziale, 5,11,12 ma i processi che regolano innervazione centrale devono ancora essere determinati. Rapporti di proiezioni acustiche cellule gangliari di solito descrivere i process…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Candace Hsieh per suggerimenti e assistenza con le tecniche di imaging e Dr. Doris Wu consultare esperti di anatomia dell'orecchio interno pulcino durante l'embriogenesi precoce. Questo lavoro è stato sostenuto da NSF IOS-0642346, NIH-DC010775 T32, T32-NIH GM008620, NIH R01-DC010796, e il DOE GAANN P200A120165.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene Weigh Dish | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
| Petri Dish, 35 X 10 mm | Fisher Scientific | 50820644 | Use to make silicone dissection dish |
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | World Precision Instruments | SYLG184 | Coat Petri to make dissection dish |
| Dissection Pins | Various | Holds embryo in place during dissection | |
| NaCL | Various | part of aCSF recipe | |
| KCl | Various | part of aCSF recipe | |
| KH2PO4 | Various | part of aCSF recipe | |
| NaHCO3 | Various | part of aCSF recipe | |
| Glucose | Various | part of aCSF recipe | |
| CaCl2 | Various | part of aCSF recipe | |
| MgSO4 | Various | part of aCSF recipe | |
| Container for aCSF. Suggest translucent wide-mouth Nalgene jar, 500 ml (16 oz) with lid. | CPLabSafety | QP-PLC-03717 | Drill hole opening in top of lid for glass bubling stem to penetrate liquid |
| Empty 5 ml glass vial or comparable transparent vial | American Pharmaceutical Partners, Inc | 6332300105 | Use during aCSF incubation to keep samples separate from each other and from the bubbling stream |
| Tank of carbogen (95%O2 / 5%CO2) connected by tubing to bubbler | Various | Attach by tubing to glass stem bubbler for infusion into aCSF | |
| Glass stem bubbler | Various | To infuse carbogen into aCSF | |
| Curved-tip forceps | World Precision Instruments | 501008 | To remove embryo head from egg |
| Two fine-tip forceps | World Precision Instruments | 501985 | For micro-dissection |
| 50 ml Beaker | various | ||
| Rhodamine Dextran Amine (RDA) | Invitrogen | various | Fluorescent axon tracer |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | ||
| Phosphate Buffered Saline, (1X PBS) | Various | Standard lab reagent | |
| Thin Wall Glass Capillaries, 1.2 OD, .9 ID 4″ (100 mm) length | World Precision Instruments | TW120F-4 | Load with RDA. Each capillary makes two glass micropipettes |
| Needle / Pipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | Settings used: Heat 16.4, Solenoid 2.2 |
| Picospritzer | Parker Instrumentation | various | Attach by fine tubing to glass micropipette |
| Micromanipulator | Narishige | various | |
| Dissection microscope with fluorescence | Various | ||
| 4% Paraformaldehyde | Various | Standard lab reagent | |
| anti-Neurofilament antibody, optional | Millipore | AB1991 | Follow histological protocol recommended by manufacturer |
| Cryostat and associated materials for sectioning | Leica | various | |
| Epifluorescent microscope for imaging | Zeiss, various |
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