En skade paradigme ved hjælp af Drosophila larve ventrale nerve ledning til at undersøge centralnervesystemet regenerering og reparation er beskrevet. Jagende efterfulgt af laser konfokal mikroskopi i time-lapse og faste prøver, kombineret med kvantitativ analyse med målrettet udviklet software og genetik, der bruges til at undersøge de molekylære mekanismer i CNS-regenerering og reparation.
En eksperimentel metode er udviklet til at undersøge de cellulære reaktioner på centralnervesystemet (CNS) skader ved hjælp af frugt-fly Drosophila. Forståelse reparation og regeneration hos dyr er et centralt spørgsmål i biologi. De beskadigede menneskelige CNS ikke regenerere, og forstå hvordan man kan fremme regenerering er et af hovedmålene for medicinsk neurovidenskab. Den kraftfulde genetiske værktøjskasse af Drosophila kan bruges til at løse problemet med CNS-regeneration.
En læsion i CNS ventrale nerve ledning (VNC, svarende til hvirveldyret rygmarv) påføres manuelt med en wolfram nål. VNC kan efterfølgende optaget i tidsforskudt anvendelse af laserscanning konfokal mikroskopi i op til 24 timer for at følge udviklingen af læsionen over tid. Alternativt kan det dyrkes og derefter fikseret og farvet ved hjælp af immunfluorescens at visualisere neuron og gliaceller med konfokal mikroskopi. Under anvendelse af passende markører, changes i cellemorfologi og celle tilstand som følge af skaden kan visualiseres. Med ImageJ og vilje udviklet plug-ins, kan kvantitative og statistiske analyser udføres for at måle ændringer i sårstørrelse over tid og effekterne af skader i celleproliferation og celledød. Disse fremgangsmåder tillader analyse af store prøvestørrelser. De kan kombineres med de magtfulde genetik Drosophila at undersøge de molekylære mekanismer, der ligger CNS regenerering og reparation.
Regenerering hos dyr viser, at celler fornemme, når organismevækst er bestilt og fuldstændig, og hvor den strukturelle integritet af en organisme opnås og opretholdes. Forståelsen af disse mystiske evner celler er af stor interesse inden for biologien. Fremme regenerering er en af de vigtigste mål for medicinsk neurovidenskab. Hos mennesker indeholder den beskadigede centralnervesystemet (CNS) ikke regenerere. Gnavermodeller for rygmarvsskade bruges til at forstå, hvordan celler reagerer på skade. Men etiske bekymringer, høje omkostninger og den langsomme livscyklus af dyrene begrænse fremskridt.
Frugten-fly Drosophila er en udbredt model organisme i udviklingsmæssige biologi og neurovidenskab. Takket være sin stærke genetiske værktøjer og korte livscyklus, har Drosophila gentagne ført til opdagelsen af genernes funktion og netværk med relevans for forståelsen af mennesker og sygdom. Der er rigeligt med beviser på evolutionær conbevarelse af genfunktion fra fluer til mennesker.
I de seneste år har flere paradigmer for nervesystemet skade blevet etableret i Drosophila. Nogle består af skade perifere nerver, der løber langs vingen eller axotomi af perifere nerver, herunder sensorisk 1 og motor axonerne 2. Men de perifere og centrale nervesystem forskellige på mange måder, og det er velkendt, at i mange dyr det perifere nervesystem kan regenerere mens CNS ikke kan. Således at forstå CNS regenerering, direkte skade i centralnervesystemet er mere passende. Stikkende skaden med en nål er blevet anvendt på Drosophila voksne hjerne at undersøge reaktion på beskadigelse 3,4. Brug en anden fremgangsmåde, Ayaz et al. Afhuggede CNS axoner i dyrkede voksne hjerner med en Piezo power microdissector, og analyserede deres regenerering i 4 dage 5. Fordelen ved disse senere eksperimentelle set ups er, at de fokuserer på hjernen, som uden tvivl er af stor interesse. Ulempen er, at hjernen er meget mere kompleks end det VNC, der kun beskæftiger sig med motorisk og sensorisk kontrol. Arbejde på den voksne hjerne er også mere tidskrævende. Larven er klar til eksperimenter i 4 dage, mens det tager ca 10 dage for voksne eclosion, og derefter yderligere 5 dage for deres modning. Den voksne hjerne er også vanskeligere at håndtere, fordi den er indkapslet i tykke kutikula, som er vanskeligt at fjerne. VNC har den yderligere tiltrækning for at være funktionelt ækvivalent til hvirveldyret rygmarven.
Drosophila larver er almindeligt anvendt som model organisme for neuroscience 6-9. Selvom strengt taget Larven er i en udviklingsfase, kan det også betragtes som en fuldt funktionel dyr. Larven har bevægelseskomponenter, flere sanser inklusive lugtesansen, smag og nociception, og indlæring og hukommelse. Således larvens VNC wsom er valgt som det ideelle model for CNS skade.
Larver og pupal VNCs kan dissekeret og dyrket i skålen, stadig bevarer cellulære integritet i op til 24 timer 10. Dette antydede, at skaden kan anvendes til VNC, som derpå kan indføres i time-lapse i løbet af dette tidsrum, eller dyrket og fastgjort på ethvert ønsket tidspunkt i denne periode.
Her præsenterer vi en eksperimentel paradigme for CNS skade ved hjælp af Drosophila larver af VNC. Den VNC først dissekeret fra larve, og jagende skade påføres manuelt med en wolfram nål. VNC placeres derefter på et glas-dækglas bund, og optaget med time-lapse laserscanning konfokal mikroskopi. Alternativt kan VNCs dyrkes i et ønsket tidsrum, og de cellulære virkninger af skaden kan analyseres i faste prøver ved hjælp af immunfarvning og konfokal mikroskopi. Sårområdet kan måles, og kvantitativ analyse af celle nowmber (celleproliferation og celledød) kan udføres med vilje udviklet software. Store stikprøvestørrelser let kan håndteres, hvilket resulterer i statistisk validerede resultater. Disse fremgangsmåder er med held blevet kombineret med de kraftige genetik af Drosophila at opdage et gen net ligger til grund for gliale regenerative respons på CNS-skade 11.
Vi har etableret en protokol for stikkende skade på Drosophila larvestadium CNS at undersøge de cellulære reaktioner til skade, reparation og regeneration. Larve VNCs dissekeres og stak, hvorefter de bliver filmet med time-lapse mikroskopi eller fastsat for fluorescens immunfarvning at visualisere glia og neuroner, apoptose eller celledeling. Progression af læsionen over tid kan måles. Denne fremgangsmåde er ledsaget af vilje udviklet software til kvantitativ og statistisk analyse af celleantal ændringer efter skade og under reparation.
Vi dolkede 96-timer AEL larver (og disse blev enten fast eller lov til at udvikle sig yderligere), en udviklingsstadiet forud for overgangen til puppe og derefter voksen flue. Ved 96 timer er VNCs store nok til stikkende, de er i midten af tredje stadium, de er altså ikke undergår forpupningen endnu, og nervesystemet er allerede fuldt funktionelt svarer til adULT. Det kunne være muligt at stikke lidt senere i larver og den præcise timing skal vælges, så den passer til forskningsspørgsmålet. Imidlertid afhængigt af de adresserede spørgsmål, vil det normalt være nødvendigt at dyrke de VNCs i nogen tid at overholde de cellulære responser på skade. Nogen tid efter 120 hr AEL forpupningen starter, en periode, hvor CNS er remodeled og er dermed bedst undgås. Således tidsvindue for knivstikkeri plus kultur i Larven er temmelig begrænset. Brug af larver stadig har en stor teknisk fordel i forhold til anvendelse af voksne: mens lighed med den voksne, nervesystemet er allerede fuldt funktionel, er ved at analysere reaktion på beskadigelse betydeligt lettere og hurtigere i larver.
Ved sammenligning af størrelsen og morfologien af hjerner og VNCs dissekeret og dyrket i en skål til VNCs, der er dissekeret fra et tilsvarende senere tidspunkt uden dyrkning i et fad, fremgår det, at udvikling er langsommere i kultur end in vivo. I andre henseenderudvikling udøver normalt i kultur, er væv integritet bevares, og celler i live viser flere svar. Wound ekspansion, neuropile reparation og glial proliferation finder sted inden for 22 timer efter stikkende. Dette viser, at cellulære reaktioner på skader finder sted i kulturen, og der er sandsynligvis ikke nødvendigt for at opretholde de eksplantater længere end en dag. Hvis langsigtet kultur blev ønskes, kan protokollen kræve yderligere optimering såsom anvendelse af en kulturplade indsatsen 5.
Det er vigtigt at identificere god kvalitet prøver fra de degenererende dem. Optimering denne protokol tager nogle færdigheder og uundgåeligt degeneration vil forekomme i nogle prøver. VNC kan erhverve en »blomkål« udseende, der afspejler en nedbrydning af væv integritet (figur 5B). Degeneration er også anerkendt af vakuolisering af det VNC uafhængigt af den stikkende, som kan være til stede i intakte, ikke-stukket prøver (figur 5C </strong>). Disse prøver skal kasseres. Degeneration er mest sandsynligt forårsaget af ru dissektion, som kan rive nerver og det beskyttende lag af overfladen glia. Således stor omhu skal tages for at dissekere forsigtigt. Andre påvirkende faktorer omfatter dyrkningsmediet, som skal holdes rene og med antibiotika, som nøje overholder de vasker og tidsindstillinger som angivet i protokollen. Endelig er længden af nålen og nålholderen, størrelse og skarphed af nålen er meget vigtige. Nåleholderen kan forurene kulturmediet og en stump nål kan medføre en stor skade, der ikke kan reparere sig selv, og vil føre til degenerering. Det er vigtigt at rutinemæssigt fastholde nålen skarpe.
I denne protokol, tog vi fordel af et protein fælde linje af fluer til at visualisere neuropile parallelt med visualisering af gliaceller processer ved hjælp af traditionelle GAL4-UAS-system. Disse værktøjer kan også kombineres med andre binære ekspressionssystemer såsom LeXA 19 og Q-systemet 20, der er uafhængige af GAL4. Dette ville muliggøre analysen af interaktioner for eksempel mellem axoner og glia processer, som respons på skade. Ved yderligere at kombinere det med andre genetiske værktøjer såsom reportere til dendritter 21 eller calciumtilstrømning 22, giver denne metode en stor mulighed for at analysere cellebiologi bag skade respons af gliaceller, neuronale axoner og dendritter i CNS. Endelig kan denne metode kombineres med standard genetik, mutationer og overekspression af gener, for at teste genfunktion i reaktioner på skader og regenerering.
Denne protokol er med held ført til opdagelsen af et gen net ligger til grund for regenerative glial respons på CNS-skade 11. I betragtning af den evolutionære bevarelse af genfunktion, optrevling disse cellulære begivenheder og genfunktioner i frugt-fluer sandsynligvis give betydelige indsigt i forståelsen af mammalian CNS reaktion på beskadigelse og regeneration.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Mei Ann Lim for kritisk gennemlæsning af manuskriptet og andre medlemmer af vores laboratorium for deres drøftelser i hele forløbet af dette arbejde. Dette arbejde blev finansieret af Yamada Science Foundation og Royal Society korte besøg Stipendier og EU Marie Curie International Incoming Fellowship GRR til KK, og BBSRC Project Grant (BB/H002278/1) og Wellcome Trust Equipment Grant (073228/Z/03/Z) til AH
Equipment | |||
Staining block | Brunel Microscope | ||
Forceps No. 5 | e.g. Fine Science Tools | e.g. 11251-20 | |
Tungsten needle: rod diameter, 0.5 mm; tip size, 1 μm; length, 2 inch | Roboz Surgical Instrument | RS-6065 | |
Needle holder | Roboz Surgical Instrument | RS-6060 | |
Arkansans stones: Repair Kit for Dumont Forceps | Fine Science Tools | 29000-00 | |
35 mm Petri dish with 27 mm glass base | Iwaki | 3930-035 | |
Leica SP2-AOBS confocal inverted microscope with environment chamber | Leica | ||
Reagent | |||
Shield and Sang M3 insect medium (ecdysone free) | Sigma | S3652-500 ml | |
Penicillin and streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | See 12 | ||
FBS | Sigma | F7524 | |
Poly-L-lysin | Sigma | P1399-25mg | |
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences | 04018-1 | |
Mouse anti-glutamine synthetase antibodies | Millipore | MAB302 | |
Rabbit anti-GFP antibodies | Life technologies | A11122 | |
Mouse anti-REPO antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 8D12 | |
Rat anti-ELAV antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 7E8A10 | |
Rabbit anti-active caspase 3 antibodies | Abcam | ab13847 | |
Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11034 | |
Anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21236 | |
Anti-rat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21247 |