En skada paradigm med Drosophila larver ventrala nerv sladd för att undersöka centrala nervsystemet förnyelse och reparation beskrivs. Stickande följt av laserskanning konfokalmikroskopi i tid-lapse och fast prover, i kombination med kvantitativ analys med målmedvetet utvecklat programvara och genetik, används för att undersöka de molekylära mekanismerna för CNS-förnyelse och reparation.
En experimentell metod har utvecklats för att undersöka de cellulära svar på centrala nervsystemet (CNS) skada med frukt-fly Drosophila. Förstå reparation och förnyelse hos djur är en viktig fråga i biologi. De skadade människor CNS inte regenerera inte, och förstå hur man kan främja förnyelse är en av de viktigaste målen för medicinsk neurovetenskap. Den kraftfulla genetiska verktygslåda av Drosophila kan användas för att hantera problemet med CNS-förnyelse.
En skada till CNS-ventrala nerv sladd (VNC, motsvarande ryggradsdjur ryggmärgen) appliceras manuellt med en volfram nål. VNC kan därefter filmas i tidsförlopp med laserskanning konfokalmikroskopi för upp till 24 timmar för att följa utvecklingen av lesionen över tiden. Alternativt, kan den odlas, fixerades därefter och färgades med användning av immunofluorescens att visualisera neuron och gliaceller med konfokalmikroskopi. Med användning av lämpliga markörer, changes i cellmorfologi och cell tillstånd till följd av skada kan visualiseras. Med ImageJ och medvetet utvecklat plug-ins, kan kvantitativa och statistiska analyser genomföras för att mäta förändringar i sårets storlek över tid och effekterna av skada i cellproliferation och celldöd. Dessa metoder tillåter analys av stora provstorlekar. De kan kombineras med de kraftfulla genetiska Drosophila för att undersöka de molekylära mekanismerna bakom CNS-förnyelse och reparation.
Regenerering i djur visar att celler känna av när organismen tillväxt beställs och fullständig, och hur strukturell integritet hos en organism uppnås och bibehålls. Att förstå dessa mystiska förmågor celler är av stort intresse för biologi. Främja förnyelse är en av de viktigaste målen för medicinsk neurovetenskap. Hos människor, inte regenerera det skadade centrala nervsystemet (CNS) inte. Gnagarmodeller av ryggmärgsskada används för att förstå hur celler svarar på skada. Men etiska frågor, höga kostnader och den långsamma livscykel djuren begränsar utvecklingen.
Frukten-fly Drosophila är en allmänt använd modell organism i utvecklingsbiologi och neurovetenskap. Tack vare dess kraftfulla genetiska verktyg och kort livslängd, har Drosophila ledde återkommande till upptäckten av genfunktioner och nätverk gen med relevans för förståelsen av människan och sjukdomar. Det finns rikliga bevis för evolutionär konbevarande av geners funktion från flugor till människor.
Under de senaste åren har flera paradigmer för nervsystemskada etablerats i Drosophila. Vissa består av skada perifera nerver som löper längs vingen eller axotomin av perifera nerver, bland sensoriska 1 och motorn axoner 2. Emellertid, de perifera och centrala nervsystemen skiljer sig åt i många avseenden, och det är väl känt att i många djur det perifera nervsystemet kan regenerera medan CNS kan inte. Således, för att förstå CNS-regenerering, direkt skada på CNS är mer lämpligt. Stickande skada med en nål har framgångsrikt tillämpats på Drosophila vuxen hjärna att undersöka svaret på skada 3,4. Använda en annan metod, analyserade Ayaz et al. Avhuggna CNS axoner i odlade vuxna hjärnor med Piezo effekt microdissector och deras förnyelse i 4 dagar 5. Fördelen med dessa senare experimentell uppsättning ups är att de fokuserar på hjärnan, som utan tvekan är av stort intresse. Nackdelen är att hjärnan är mycket mer komplex än VNC, som endast behandlar motorisk och sensorisk kontroll. Arbeta på den vuxna hjärnan är också mer tidskrävande. Larven är redo för experiment i 4 dagar, medan det tar ca 10 dagar för vuxna eclosion och sedan ytterligare 5 dagar för deras mognad. Den vuxna hjärnan är också svårare att hantera, eftersom den är inkapslad i tjocka nagelband, som är svår att avlägsna. VNC har den ytterligare attraktion att vara funktionellt ekvivalent till ryggradsdjuret ryggmärgen.
Drosophila larv används allmänt som en modell organism för neurovetenskap 6-9. Även egentligen larven är i en utvecklingsfas, kan det också vara en fullt fungerande djur. Larven har förflyttning, flera sinnen inklusive luktsystemet, smak och nociception samt inlärning och minne. Således larver VNC wsom valts som den idealiska modellen för CNS-skada.
Larver och pupal VNCs kan dissekeras och odlas i skålen, fortfarande bibehåller cellulär integritet under upp till 24 timmar 10. Detta antydde att skada skulle kunna tillämpas på VNC, som sedan kan registreras i tidsförlopp för över denna tidsperiod, eller odlades och fixerades vid varje önskad tidpunkt under denna period.
Här presenterar vi en experimentell paradigm för CNS-skada med Drosophila larver VNC. VNC först dissekeras från larv och stickande skador appliceras manuellt med en volfram nål. VNC placeras sedan på en glas-botten täckglas, och filmade med tidsförlopp laserskanning konfokalmikroskopi. Alternativt kan VNCs odlas under en önskad tidsperiod, och de cellulära effekterna av skada kan analyseras i fasta prover med immunfärgning och konfokalmikroskopi. Sårområdet kan mätas, och kvantitativ analys av cellens Number (cellproliferation och celldöd) kan utföras med avsiktligt utvecklad mjukvara. Stora provstorlekar kan lätt hanteras, vilket resulterar i statistiskt validerade resultat. Dessa metoder har framgångsrikt kombinerat med de kraftfulla genetik av Drosophila att upptäcka en gen nätverk bakom glia regenerativa responsen på CNS-skada 11.
Vi har etablerat ett protokoll för stickande skada på Drosophila larver CNS för att undersöka de cellulära svaren på skada, reparation och förnyelse. Larver VNCs dissekeras och knivhuggen, varefter de filmas med time-lapse mikroskopi eller fastställts för fluorescens immunfärgning att visualisera glia och neuroner, apoptos eller celldelning. Fortskridandet av lesionen över tiden kan mätas. Denna metod åtföljs av avsiktligt utvecklad mjukvara för kvantitativ och statistisk analys av cellantalet ändras vid skada och under reparation.
Vi knivhögg 96-timmars AEL larver (och dessa var antingen fast eller få utvecklas vidare), en utvecklingsstadium före övergången till puppa och sedan vuxen fluga. Vid 96 h, VNCs är tillräckligt stora för stickande, de är i mitten av tredje stadiet steg och därför inte genomgår förpuppning ännu, och nervsystemet redan fullt fungerande liknar annonsenUlt. Det kan vara möjligt att sticka något senare i larver och den exakta tidpunkten måste väljas för att passa frågeställningen. Beroende på de adresserade frågor, är det i allmänhet nödvändigt att odla VNCs en tid att observera de cellulära svaren på skada. En tid efter 120 tim AEL pupation startar, en period då CNS är nyskapad och är därmed bäst undvikas. Således tidsfönstret för stickande plus kultur i larven är ganska begränsad. Använda larver fortfarande har en stor teknisk fördel jämfört med vuxna: medan, på samma sätt som vuxna, är det nervsystemet redan fullt fungerande, analyserar svaret på skadan betydligt enklare och snabbare i larver.
Vid jämförelse av storleken och morfologin hos hjärnan och VNCs dissekerade och odlades i en skål till VNCs som dissekeras på motsvarande senare tidpunkt utan odling i en skål, förefaller det som om utvecklingen är långsammare i kultur än in vivo. I andra avseenden,utveckling bedriver normalt i kultur bevaras vävnad integritet och celler lever visar flera svar. Sår expansion, neuropile reparation och glia spridning ske inom 22 timmar efter huggande. Detta visar att cellulära svar på skada ske i kultur och det finns troligen inget behov av att behålla explantaten längre än en dag. Om längre sikt odling önskas kan protokollet kräva ytterligare optimering som att använda en insats odlingsplatta 5.
Det är viktigt att identifiera god kvalitet prover från degenererande sådana. Optimera detta protokoll tar lite skicklighet och oundvikligen degenerering kommer att ske i vissa exemplar. VNC kan få en "blomkål" utseende som återspeglar en uppdelning av vävnad integritet (figur 5B). Degeneration är också erkänts av vakuolisering av VNC oberoende av stickande, som kan vara närvarande i intakta, icke-stabbed prover (figur 5C </strong>). Dessa prover måste kasseras. Degeneration är sannolikt orsakad av grov dissektion, som kan riva nerver och det skyddande lagret av ytan glia. Därför stor försiktighet måste vidtas för att dissekera försiktigt. Andra påverkande faktorer är odlingsmediet, som måste hållas rena och med antibiotika, strikt respekterar tvättar och tider som anges i protokollet. Slutligen, längden av nålen och nålhållaren, storlek och skärpa av nålen är mycket viktiga. Nålhållaren kan förorena odlingsmediet och en trubbig nål kan orsaka en stor skada som inte kan reparera sig själv och kommer att leda till degenerering. Det är viktigt att rutinmässigt bibehålla nålen skarpa.
I detta protokoll, vi drog fördel av ett protein fälla linje av flugor att visualisera neuropile parallellt med visualisering av gliaceller processer med hjälp av traditionella GAL4-UAS-system. Dessa verktyg kan också kombineras med andra system binära uttryck som LexA 19 och Q-systemet 20, som är oberoende av GAL4. Detta skulle göra det möjligt att analysera samspelet t.ex. mellan axoner och gliaceller processer, som svar på skada. Genom att ytterligare kombinera det med andra genetiska verktyg som reportrar för dendriter 21 eller kalciuminflödet 22, ger denna metod en stor möjlighet att analysera cellbiologi bakom skadan respons av gliaceller, neuronala axoner och dendriter i CNS. Slutligen kan detta förfarande kombineras med standard genetik, mutationer och över-uttryck av gener, för att testa genfunktion i svar på skada och regenerering.
Detta protokoll har framgångsrikt lett till upptäckten av en gen nätverk bakom den regenerativa glia svar på CNS-skada 11. Med tanke på den evolutionära bevarande av genfunktion, reda ut dessa cellulära händelser och funktioner gen i frukt-flugor kommer sannolikt att ge betydande insikter i förståelsen av mammalian CNS svar på skada och förnyelse.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Mei Ann Lim för kritisk läsning av manuskriptet och andra medlemmar av vårt labb för sina diskussioner under loppet av detta arbete. Detta arbete har finansierats av Yamada Science Foundation och Royal Society Korta stipendier besök och EU Marie Curie internationellt inkommande stipendium GRR till KK, och BBSRC projektbidrag (BB/H002278/1) och Wellcome Trust utrustning (073228/Z/03/Z) till AH
Equipment | |||
Staining block | Brunel Microscope | ||
Forceps No. 5 | e.g. Fine Science Tools | e.g. 11251-20 | |
Tungsten needle: rod diameter, 0.5 mm; tip size, 1 μm; length, 2 inch | Roboz Surgical Instrument | RS-6065 | |
Needle holder | Roboz Surgical Instrument | RS-6060 | |
Arkansans stones: Repair Kit for Dumont Forceps | Fine Science Tools | 29000-00 | |
35 mm Petri dish with 27 mm glass base | Iwaki | 3930-035 | |
Leica SP2-AOBS confocal inverted microscope with environment chamber | Leica | ||
Reagent | |||
Shield and Sang M3 insect medium (ecdysone free) | Sigma | S3652-500 ml | |
Penicillin and streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | See 12 | ||
FBS | Sigma | F7524 | |
Poly-L-lysin | Sigma | P1399-25mg | |
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences | 04018-1 | |
Mouse anti-glutamine synthetase antibodies | Millipore | MAB302 | |
Rabbit anti-GFP antibodies | Life technologies | A11122 | |
Mouse anti-REPO antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 8D12 | |
Rat anti-ELAV antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 7E8A10 | |
Rabbit anti-active caspase 3 antibodies | Abcam | ab13847 | |
Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11034 | |
Anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21236 | |
Anti-rat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21247 |