형질 전환 생선의 본래 뇌에서 발견 뉴런의 전기적 활동을 기록
Summary
이 비디오에서는, 우리는 복잡한 신경 회로를 유지하는 뇌 전체 준비에서 확인 된 하나의 뉴런에서 전기 활동을 기록하는 방법을 보여줍니다. 우리는 성선 자극 호르몬 분비 호르몬 (GnRH의) 신경 세포가 유전자 손상 뇌의 준비 식별을위한 형광 단백질로 태그 된 유전자 변형 물고기를 사용합니다.
Abstract
복잡한 행동을 조절하는 신경 회로의 세포 생리학을 이해하는 것은이 작품은 CNS의 신경 회로가 그대로 남아 그대로 뇌의 준비에서 수행 할 수있는 모델 시스템을 사용하여 크게 향상됩니다. 우리는 성선 자극 호르몬 분비 호르몬 (GnRH의) 신경 세포가 유전자 손상 뇌의 식별을 위해 녹색 형광 단백질로 태그 된 유전자 변형 물고기를 사용합니다. 물고기 GnRH의 뉴런의 여러 인구를 가지고 있고, 그 기능은 뇌의 위치와 그들이 1을 표현하는 GnRH의 유전자에 따라 달라집니다. 우리는 유전자 변형 송사리의 손상 뇌 (그림 1B 및 C)를 사용하여 후각 전구에 연결된 터미널 신경 (TN)에 위치한 GnRH3 신경에 우리의 시범 초점을 맞추고있다. 연구는 송사리 TN-GnRH3 뉴런은 중추 신경계에 외부 환경으로부터 정보를 송신기 역할을 neuromodulatory 것을 제안, 티셔츠헤이로 잘 알려진 시상 하부 GnRH1 신경 세포 2, 3을 수행합니다. TN-GnRH3 뉴런의 자발적인 활동 전위 사격 토닉 패턴이 고유의 속성을 4-6, 주파수, 뇌하수체 – 생식선 기능 조절에 직접적인 역할을하지 않는다 어느 것이 conspecifics 2 신경 펩타이드 kisspeptin 5에서 시각적으로 변조된다. 이 비디오에서는, 우리는 TN-GnRH3 뉴런이 어떻게 뉴런을 식별하고 뇌 전체에 자신의 전기 활동을 모니터링하는 방법을 보여 강화 된 녹색 형광 단백질 7에 연결 Gnrh3의 프로모터 부위를 포함하는 유전자를 표현하는 형질 전환 송사리의 안정적인 회선을 사용 준비 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
GnRH의 3 GFP 유전자 변형 물고기는 신경 세포의 통합과 직간접 적으로 재생 3, 8-10에 관여 둘 다 행동의 중앙 제어 규제의 근간이되는 신경 생리 학적 메커니즘을 연구하는 독특한 모델을 제공합니다. 이 모델 시스템의 중요한 장점 중 하나는 GFP를 표현하는 많은 GnRH3 뉴런은 신경 회로 6, 9, 11, 12 (그림 방해하지 않고 전기 생리학 기록을 위해 신경을 비교적 쉽게 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 기술 지원을위한 박사 멩 턱 린 양 위안 동 감사합니다. 이 작품은 건강 HD053767의 국립 연구소 (NLW에 하청)에서 교부금에 의해 캘리포니아 로스 앤젤레스의 연구 대학 (NLW)를위한 부총장의 생리학 및 Office의 부서에서 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus | BX50W (Upright) | |
| Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 200B | |
| A-D converter | Computer Interference Corp. | Digidata ITC-18 | |
| Cooled CCD camera | PCO Computer Optics | Sensicam | |
| Xenon lamp | Sutter Instruments Co. | ||
| GFP filter set | Chroma Technologies | ||
| Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | Slidebook software | |
| Electrophysiology Data Acquisition Software | Axon Instruments | Axograph software | |
| Electrophysiology Data Acquisition Software | AD Instruments Inc. | PowerLab | |
| Headstage for electrophysiology | Axon Instruments | CV 203BU | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-285 | |
| Recording Chamber Platform | Warner Instrument Corp. | P1 | |
| Recording Chamber | Warner Instrument Corp. | RC-26G | |
| Electrode Puller | Sutter instruments | P87 | |
| Filament for electrode puller | Sutter Instruments | FB330B | 3.0 mm wide trough filament |
| 1.5 mm glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | Microelectrode for recording |
| Syringe | Becton Dickinson | 309586 | 3 ml |
| MS-222 | Sigma | E10521-10G | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt |
| Fish saline | mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 HEPES | ||
| Electrode solution (loose-patch) | mM: 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 glucose | ||
| Electrode solution (whole-cell patch) | mM: 112.5 K-gluconate; NaCl; 17.5 KCl; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0.1 leupeptin;10 phospho-creatine |
References
- Kah, O., Lethimonier, C., Lareyre, J. J. Gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) in the animal kingdom. J. Soc. Biol. 198 (1), 53-60 (2004).
- Ramakrishnan, S., Wayne, N. L. Social cues from conspecifics alter electrical activity of gonadotropin-releasing hormone neurons in the terminal nerve via visual signals. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 297 (1), R135-R141 (2009).
- Abe, H., Oka, Y. Mechanisms of neuromodulation by a nonhypophysiotropic GnRH system controlling motivation of reproductive behavior in the teleost. 57 (6), 665-674 (2011).
- Oka, Y. Tetrodotoxin-resistant persistent Na+ current underlying pacemaker potentials of fish gonadotrophin-releasing hormone neurones. J. Physiol. 482 (Pt. 1), 1-6 (1995).
- Zhao, Y., Wayne, N. L. Effects of Kisspeptin1 on Electrical Activity of an Extrahypothalamic Population of Gonadotropin-Releasing Hormone Neurons in Medaka. PLoS One. 7 (5), e37909 (2012).
- Wayne, N. L., et al. Whole-cell electrophysiology of gonadotropin-releasing hormone neurons that express green fluorescent protein in the terminal nerve of transgenic medaka (Oryzias latipes). Biol. Reprod. 73 (6), 1228-1234 (2005).
- Okubo, K., et al. Forebrain gonadotropin-releasing hormone neuronal development: insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
- Okubo, K., et al. A novel form of gonadotropin-releasing hormone in the medaka, Oryzias latipes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 276 (1), 298-303 (2000).
- Ramakrishnan, S., et al. Acquisition of spontaneous electrical activity during embryonic development of gonadotropin-releasing hormone-3 neurons located in the terminal nerve of transgenic zebrafish (Danio rerio). Gen. Comp. Endocrinol. 168 (3), 401-407 (2010).
- Abraham, E., et al. Targeted gonadotropin-releasing hormone-3 neuron ablation in zebrafish: effects on neurogenesis, neuronal migration, and reproduction. Endocrinology. 151 (1), 332-340 (2010).
- Wayne, N. L., Kuwahara, K. Beta-endorphin alters electrical activity of gonadotropin releasing hormone neurons located in the terminal nerve of the teleost medaka (Oryzias latipes. Gen. Comp. Endocrinol. 150 (1), 41-47 (2007).
- Oka, Y. Three types of gonadotrophin-releasing hormone neurones and steroid-sensitive sexually dimorphic kisspeptin neurones in teleosts. J. Neuroendocrinol. 21 (4), 334-338 (2009).
- Molleman, A. . Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , (2003).
