Долгосрочные молчание интерсектин-1 в легких мышей по повторной сдачи Конкретные миРНК через катионные липосомы. Оценка нокдаун эффекты электронной микроскопией
Summary
Повторные ретро-орбитальной инъекции катионные комплексы liposomes/siRNA/ITSN-1s у мышей, каждые 72 часа в течение 24 дней, эффективной доставки миРНК дуплекс с микрососудов легких у мышей снижение ITSN-1 мРНК и экспрессию белка на 75%. Этот метод хорошо воспроизводимый в животной модели, не имеет побочных эффектов и позволяет избежать летальных исходов.
Abstract
Предыдущие исследования показали, что нокдаун ITSN-1S (KD ITSN), эндоцитотический белок, участвующий в регуляции проницаемости сосудов легких и эндотелиальные клетки (ECS) выживание, индуцированного апоптоза, основным препятствием в развитии системы клеточных культур с длительным ITSN-1S торможения 1. Использование катионных липосом в качестве носителей, мы исследовали молчание ITSN-1 гена в легких мышей при системном введении миРНК ориентации ITSN-1 ген (миРНК ITSN). Катионные липосомы обладают рядом преимуществ для доставки миРНК: Допускаются повторные дозировки, неиммуногенные, нетоксичны и легко производить 2. Липосомы производительности и биологической активности зависит от их размера, заряда, липидный состав, стабильность, доза и способ введения 3 Здесь, эффективный и специфический KD ITSN в легких мышей были получены с использованием холестерина и диметил диоктадецил сочетание бромид аммония. Внутривенного введениямиРНК ITSN / катионной липосомы комплексы временно сбил ITSN-1 белка и мРНК в легких мышей на 3 день, который восстановился после еще 3 дня. Воспользовавшись тем, что катионные липосомы как безопасного перевозчика, повторяемые, исследование продлен на 24 дней. Таким образом, ретроорбитальной лечения с только что созданной комплексы вводили каждые 3 дня, вызывая устойчивый KD ITSN на протяжении всего исследования 4. Мышь ткани, собранные в нескольких временных точках после миРНК ITSN подвергали электронной микроскопии (ЭМ) анализы, чтобы оценить эффекты хронического KD ITSN, в легких эндотелия. Высокое разрешение изображения EM позволило нам оценить морфологические изменения, вызванные KDITSN в постели легких сосудистого (т.е. разрушение эндотелиального барьера, снижение количества кавеолы и активацию альтернативные пути транспортировки), характеристики необнаруженными с помощью световой микроскопии. Общая этих выводов установленным важноеважную роль ITSN-1 в функции ЭКС и легких гомеостаза, а иллюстрирующие эффективность миРНК-липосомы доставки в естественных условиях.
Introduction
Голые миРНК не может проникать через клеточную мембрану электрический заряд, и она легко разрушается ферментами в крови, тканей и клеток. Даже недавно структурных модификаций для улучшения стабильности, миРНК накопление в сайте-мишени после введения чрезвычайно низка и требует эффективного внутриклеточных транспортных средств 5. Катионные липосомы стала безопасной нуклеиновых кислот носителей с потенциалом для передачи больших фрагментов ДНК / РНК в клетки путем инкапсуляции и защиты нуклеиновых кислот из ферментативного расщепления 6. Кроме того, катионные липосомы спонтанно взаимодействуют с ДНК / РНК, тем самым способствуя переноса генов в клетки 2. Совсем недавно липосомы были применены для доставки вакцин и низким молекулярным весом препаратов 7. Липосомальной доставки микроРНК-7, экспрессирующих плазмид преодолевает рецептора эпидермального фактора роста ингибитор тирозинкиназы сопротивление в клетках рака легких 8. При ориентациисосудистого эндотелия, внутривенного введения важно, потому что комплексы вряд ли пересечь барьер эндотелиальных и вытекать из сосудов в ткань и интерстиций 9. По сравнению с другими органами, КЕ из микрососудов легких имеют наибольшее поглощение и жадно интернализации катионной липосомы и ДНК / РНК комплексов, а затем в лимфатических узлах и пейеровых бляшек 9. Внутривенное доставки на моделях грызунов миРНК через ретро-орбитальной или хвостовой вены инъекций было доказано безвредны даже в высоких концентрациях, например, 50 мг / кг 10. В опубликованной литературе состав катионные липосомы отличается на основе липидов разработки и их эквимол рном соотношении 11, 12. Существует широкий спектр потенциальных приложений с использованием катионных липосом для доставки генов в естественных условиях, будь таргетинга down-regulation/over-expression белков, поставка вакцин или противоопухолевой терапии 13-15. Важно помнить,является то, что эффективность ДНК / РНК-клеточное взаимодействие мембраны регулируется форма связи между генерируется комплексов и мембранных липидов. Это предполагает, что пошива липиды состав к целевой сотовой профилей мембрана может быть полезно и в результате высокий уровень трансфекции в конкретном типе клеток 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Основываясь на предыдущих исследованиях, опубликованных другими 9 и 1, нам, 18 мы разработали эту методику для долгосрочного сбить из ITSN-1S в естественных условиях повторных внутривенного введения (каждые 72 ч, в течение 24 дней подряд) специфических миРНК / липосомы комплек…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа выполнена при поддержке Национального института здравоохранения R01HL089462 Гранты для SP.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | |
| Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB) | Sigma-Aldrich | D2779 | |
| LiposoFast stabilizer (mini-extruder) | Avestin Inc. | LF-STB | |
| Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore | Avestin Inc. | LFM-50 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-8667 | |
| Chloroform | Mallinckrodt Chemicals | 4432-04 | |
| Hank’s balanced salts | Sigma-Aldrich | H1387 | |
| Round-bottom flask | Fisher Scientific | FHB-275-030X | |
| Mouse siRNAITSN – on target | Dharmacon/ThermoScientific | J-046912-11 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | REGLO-CDF digital with RHOO pump head | |
| Ventilator | Hugo Sachs Electronik | NA | |
| Barbital | Sigma-Aldrich | B-0500 | |
| Uranyl acetate | EM Sciences | 22400 | |
| Epon812 | EM Sciences | Discontinued by the manufacturer | |
| Propylene oxide | EM Sciences | 20400 | |
| Embedding molds | EM Sciences | 69923-05 | |
| Tannic acid | EM Sciences | 21710 | |
| 8 nm gold-albumin tracer | Prepared in the laboratory as in16 | ||
| Comments | |||
| Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1) | |||
| Pyrex, 100 ml | |||
| Modified siRNA, in vivo | |||
| Part of IDEX corp. | |||
| D-79232 March, Germany | |||
| Replaced with Embed812, cat. # 14120 |
References
- Predescu, S. A., Predescu, D. N., Knezevic, I., Klein, I. K., Malik, A. B. Intersectin-1s regulates the mitochondrial apoptotic pathway in endothelial cells. J. Biol. Chem. 282 (282), 17166-17178 (2007).
- Uddin, S. Cationic lipids used in non-viral gene delivery systems. Biotechnology and Molecular Biology Review. 2 (2), 58-67 (2007).
- Barenholz, Y., et al. Influence of lipid composition on the thermotropic behavior and size distribution of mixed cationic liposomes. J. Colloid Interface Sci. (356), 46-53 (2011).
- Predescu, D. N., Neamu, R., Bardita, C., Wang, M., Predescu, S. A. Impaired caveolae function and upregulation of alternative endocytic pathways induced by experimental modulation of intersectin-1s expression in mouse lung endothelium. Biochem. Res. Int.. (2012), 672705 (2012).
- Higuchi, Y., Kawakami, S., Hashida, M. Strategies for in vivo delivery of siRNAs: recent progress. BioDrugs. 24 (24), 195-205 (2010).
- Caracciolo, G., Amenitsch, H. Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes. Eur. Biophys. J. , (2012).
- Barnier Quer, C., Elsharkawy, A., Romeijn, S., Kros, A., Jiskoot, W. Cationic liposomes as adjuvants for influenza hemagglutinin: more than charge alone. Eur. J. Pharm. Biopharm. 81 (81), 294-302 (2012).
- Rai, K., et al. Liposomal delivery of MicroRNA-7-expressing plasmid overcomes epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistance in lung cancer cells. Mol. Cancer Ther. (10), 1720-1727 (2011).
- McLean, J. W., et al. Organ-specific endothelial cell uptake of cationic liposome-DNA complexes in mice. Am. J. Physiol. (273), H387-H404 (1997).
- Soutschek, J., et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. (432), 173-178 (2004).
- Barenholz, Y. Liposomes enhance bioremediation of oil-contaminated soil. J. Liposome Res. (13), 1-8 (2003).
- Zamboni, W. C. Liposomal, nanoparticle, and conjugated formulations of anticancer agents. Clin. Cancer Res. (11), 8230-8234 (2005).
- Newman, M. S., Colbern, G. T., Working, P. K., Engbers, C., Amantea, M. A. Comparative pharmacokinetics, tissue distribution, and therapeutic effectiveness of cisplatin encapsulated in long-circulating, pegylated liposomes (SPI-077) in tumor-bearing mice. Cancer Chemother Pharmacol. (43), 1-7 (1999).
- Martino, S., et al. Efficient siRNA delivery by the cationic liposome DOTAP in human hematopoietic stem cells differentiating into dendritic cells. J. Biomed. Biotechnol. (2009), 410260 (2009).
- Zhang, G., et al. A delivery system targeting bone formation surfaces to facilitate RNAi-based anabolic therapy. Nat. Med. 18 (18), 307-314 (2012).
- Predescu, D., Palade, G. E. Plasmalemmal vesicles represent the large pore system of continuous microvascular endothelium. Am. J. Physiol. (265), H725-H733 (1993).
- Koh, T. W., Verstreken, P., Bellen, H. J. Dap160/intersectin acts as a stabilizing scaffold required for synaptic development and vesicle endocytosis. Neuron. (43), 193-205 (2004).
- Miyawaki-Shimizu, K., et al. . Lung Cell Mol. Physiol. (290), L405-L413 (2006).
