Direct Imaging van ER Calcium met Targeted-esterase-Induced Dye Loading (TED)

Summary

Gerichte-esterase geïnduceerde kleurstof laden (TED) ondersteunt de analyse van de intracellulaire calcium winkel dynamiek door fluorescentie beeldvorming. De methode baseert op richten van een recombinant carboxylesterase het endoplasmatisch reticulum (ER), waar het verbetert de lokale ontmaskering van synthetische lage affiniteit Ca^{2 +} Indicator kleurstoffen in het ER lumen.

Abstract

Visualisatie van calciumdynamiek is belangrijk om de rol van calcium in celfysiologie begrijpen. Aan calcium dynamiek te onderzoeken, hebben synthetische fluorescerende ^{Ca2 +} indicatoren populair geworden. Hier laten we TED (= gericht esterase-geïnduceerde loading dye), een werkwijze voor de afgifte van ^{Ca2 +} verbetering indicator kleurstoffen in het ER lumen van verschillende celtypes. Tot op heden werd TED in cellijnen, gliacellen en neuronen in vitro. TED bases op efficiënte, recombinant richten van een hoge carboxylesterase activiteit om het ER lumen met behulp van vector-constructies die express carboxylesterasen (CES). De meest recente TED vectoren bevatten een kernelement van CES2 gefuseerd met een rood fluorescerend eiwit, waardoor gelijktijdig twee-kleuren beeldvorming. De dynamiek van de vrije calcium in het ER worden afgebeeld in een kleur, terwijl de desbetreffende ER structuur verschijnt in het rood. Aan het begin van de procedure worden cellen getransduceerd met een lentivirus. Vervolgens, de geïnfecteerde cellen eenopnieuw gezaaid op dekglaasjes om eindelijk live cell imaging mogelijk. Vervolgens worden levende cellen geïncubeerd met de acetoxymethylester (AM-ester) vorm van lage-affiniteit Ca ^{2 +-indicatoren,} bijvoorbeeld Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, of Mag-fura2-AM. De esterase activiteit in de ER klieft uit hydrofobe zijketens van de AM-vorm van de Ca ^{2 +-indicator} en een hydrofiele fluorescerende kleurstof / Ca ^{2 +} complex wordt gevormd en opgesloten in het ER lumen. Na kleurstof laden, worden de cellen geanalyseerd op een omgekeerde confocale laser scanning microscoop. Cellen zijn continu geperfuseerd met Ringer-achtige oplossingen en de ER calciumdynamiek direct gevisualiseerd door time-lapse imaging. Calcium afgifte uit het ER wordt geïdentificeerd door een afname in fluorescentie-intensiteit in de gebieden van belang, terwijl het bijvullen van de ER calcium opslag veroorzaakt een toename in fluorescentie-intensiteit. Tenslotte wordt de verandering in fluorescentie-intensiteit in de tijd bepaald door berekening van AF / F _0.

Introduction

Om de fysiologische calcium reacties van de ER op te lossen, hebben we een nieuwe strategie om de vangst van synthetische calcium-gevoelige kleurstoffen in de ER verbeteren ontwikkeld. De methode kan de directe, niet-verstorende real-time monitoring van de vrije ER calcium in aanwezigheid van extracellulair calcium.

Functie en signalering van ER Calcium

Calcium signalen zijn te vinden in verschillende celtypen, bijvoorbeeld spier-cellen, neuronen en gliacellen en hun functies variëren van bemiddelen spiercontractie om een betrokkenheid bij synaptische transmissie in leren en geheugen ^1,2. Veranderingen in de concentratie vrij calcium van groot wetenschappelijk belang omdat calcium is betrokken bij de regulatie van gentranscriptie, celproliferatie, neuronale prikkelbaarheid, celdood en andere cel signalerende gebeurtenissen ^1-7. Al deze cellulaire calcium signalen functioneel verbonden en bijdragen tot intracellulaire calciumwinkel dynamiek ^8-10.

Een gemeenschappelijk kenmerk van alle calcium signalen is de stroom van calcium tussen de extracellulaire ruimte, het cytosol en organellen, vooral de ER en mitochondria. Hierdoor dynamische veranderingen in calciumconcentratie in deze organellen, die worden waargenomen door verschillende signaleringscomponenten. In het algemeen is de calciumconcentratie in het ER varieert tussen 100-800 uM, in het cytosol de calciumconcentratie dicht bij 100 nM en in de extracellulaire ruimte is de concentratie ongeveer 1-2 mM. Dienovereenkomstig is er een grote chemische motor voor calcium stromen naar het cytosol ^2,9,10.

De meest onderzochte ER-afgeleide calcium signalen afhankelijk van de stimulatie van G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR) die vervolgens activeren fosfolipase C (PLC). PLC op zijn beurt produceert inositol 1,4,5-trifosfaat _(IP-3) ^1. Na binding van _IP3 zijn receptor (IP _3-Rec, figuur 1) in de ER-membraan, worden calciumionen vrij uit het ER lumen. Historisch gezien, IP _{3-gemedieerde} calcium vrijlating uit de ER was eerste – hoewel indirect – gemeten in acinar alvleeskliercellen door Streb et al. in 1983 ^11.. Deze publicatie voorgesteld voor het eerst een signalerende cascade met acetylcholine, fosfolipase C en _IP3. Deze manier van calcium release algemeen aangeduid _{IP3-geïnduceerde} calciumafgifte (IiCR) (figuur 1). Kinase-afhankelijke activering van fosfolipase Cy door receptor tyrosine kinases banden de actie van groeifactoren en neurotrofe factoren aan ER calcium signalering na IP ₃ elevatie ^12. Naast IiCR, kan calcium hoogte worden gemedieerd door ionotrope calciumingang, bijvoorbeeld via spanningsafhankelijke calciumkanalen (Ca _V) en vervolgens calcium geïnduceerde calcium afgifte (CICR) door re ryanodineceptors (RyR). IiCR en CKP zijn fysiologisch gekoppeld aan winkel-bediende calciumingang (SOCE). SOCE omvat de werking van STIM (stroma interactie molecule), een sensor voor ER calcium release. STIM is aangetoond extracellulair calcium ingang stimuleren door transient receptor potential kanalen (Trp) ¹³ Orai calciumkanalen ¹⁴ en zelfs spanningsafhankelijke calciumkanalen ¹⁵ (figuur 1). Verlies van ER calcium wordt dynamisch gered door de werking van de sarco-endoplasmatisch reticulum calcium ATPase (SERCA), die actief pompen calcium terug in het ER. Het blokkeren van de SERCA met drugs zoals thapsigargin onthult een continu verlies van ER calcium aan de cytosolische compartiment. Deze ER calcium "lek" wordt veroorzaakt door ER intramembrane porie complexen zoals het Sec61-eiwitcomplex ^16,17 (Figuur 1).

In 1998 Berridge publiceerde een model, de "neuron binnen een neuron model", which suggereert een principe fysiologische rol van de ER in het integreren van neuronale calcium ^5. Dit model beschouwt het bestaan ​​van een continu ER membraan systeem vormen een intracellulair "imago" van de neuronale plasmamembraan ^5. Deze binaire eukaryote membraan systeem werd beweerd dat een basisvoorwaarde voor temporele en ruimtelijke integratie van snelle en langzame calcium signalen in neuronen zijn. Calcium signalen die ofwel optreden gelijktijdig of nadien in verschillende stekels of dendrieten van de zelfde neuron worden verleend aan soma of nucleus via de ER, waar ze worden opgeteld ^5,18 van de cel. Dan kunnen hun som effecten op de prikkelbaarheid van het neuron, regulatie van gen transcriptie of integratie van signaleringscascades hebben. Dus de ER ondersteunt de integratie van calcium signalen. Een voorwaarde voor dit concept is de continuïteit van de ER in een cel, die is geclaimd door verscheidene studies die bewezen althans somato-dendritic gebieden en de korte afstand axonale projecties ^19-21. Of sprake is van ER continuïteit binnen lange axonale projecties is een kwestie van debat.

Strategieën om de stroom van vrij calcium via ER membraan meten

Calcium signalen worden meestal gevolgd in het cytosol ^22,23. Derhalve kan niet gemakkelijk worden onderscheiden of Ca ^{2 +} stroomt in het cytosol van extracellulaire of intracellulaire opslagplaatsen ^6,24. Om deze beperking te omzeilen, hebben methodologische strategieën voor directe ER calcium beeldvorming ontwikkeld. Samenvattend worden de volgende strategieën: (1) ER-gerichte genetisch gemanipuleerde eiwit-indicatoren ^25-27 eiwit gebaseerde lage affiniteit ^{Ca2 +} indicatoren de bioluminescent eiwit GFP aequorine of in combinatie met een calcium gevoelige eiwit.. Deze genetisch gemanipuleerde Ca ^{2 +-indicatoren} (GECIS) kangericht naar de ER met behulp van een signaalpeptide en actief blijven in het ER met een retentietijd en retrieval motief. Gemeenschappelijke ER Ca ^{2 +-indicatoren} te baseren op de Cameleon principe en zijn de Cameleon YC4.3 ^26,28; Cameleon split YC7.3ER ^29, en Cameleon D1 ^30. (2) Direct esterase-based dye laden van AM-ester lage affiniteit Ca ^{2 +-indicatoren 31,32.} AM-derivaten van de indicator kleurstoffen (Mag-fura2-AM, Mag-Fluo4-AM of Fluo5N-AM) passeren de biologische membranen in een lipofiele, calcium-ongevoelige toestand. Vervolgens, in het cytosol en in de ER, endogene esterases splitsen van de AM-estergroep en laat de Ca ^{2 +-indicator,} met achterlating van een bepaalde hoeveelheid actieve kleurstof in het cytosol en in de ER. Daarom is deze benadering bruikbaar onder omstandigheden van een hoge concentratie calcium in de ER zolang de cytosolische calciumconcentratie ruim beneden de debescherming limiet van de lage-affiniteit-indicatoren, met name tijdens karakteristieke calcium signalen (bijv. nM tot laag uM). (3) AM-ester loading in combinatie met plasma membraan permeabilisatie ^32. Overgebleven cytosolische Ca ^{2 +-indicator} wordt verwijderd door plasma-membraan permeabilisatie met kleine hoeveelheden van een "mild" detergens (bijvoorbeeld saponine) in een kunstmatige intracellulaire buffer. Aldus kan de intracellulaire membranen worden gestimuleerd, bijv. met _IP3 in de intracellulaire buffer, rechtstreeks via "poriën" in de plasmamembraan. (4) Dialyse van het cytosol onder whole-cell configuratie en gelijktijdige metingen van Ca ^{2 +} in het ER lumen en het cytosol ^32,33. Een cel wordt eerst geladen met een lage affiniteit Ca ^{2 +-indicator} (bijv. Mag-fura2- AM, ratiometrisch, UV-licht). Daarna, met de hulp van een patch pipet, eventueel resterende cytosolic lage affiniteit Ca ^{2 +-indicator} wordt gedialyseerd uit het cytosol met een buffer met een hoge affiniteit Ca ^{2 +-indicator} (bijv. Fluo-3, zichtbaar licht). Deze strategie maakt het mogelijk gelijktijdig opnemen van cytosol en ER afgeleide signalen. (5) Gerichte-esterase-geïnduceerde kleurstof laden ^8,34. A carboxylesterases (CES) is gericht op het lumen van het ER en biedt een high esterase activiteit efficiënte vangst van de AM-ester vorm van lage affiniteit ^{Ca2 +} indicatoren.

Gerichte-esterase geïnduceerde kleurstof laden (TED)

Het richten van lage-affiniteit Ca ^{2 +-indicatoren} om de ER lumen te verbeteren, is TED ontwikkeld. TED vereist overexpressie van een ER gerichte muis carboxylesterase (CES2) (Figuur 2), hetgeen wordt bereikt door expressieconstructen. Cellen die een recombinant CES-construct worden geïncubeerd met het AM-ester vorm van calcium inindicator kleurstof (Fluo5N-AM, figuur 2). Vervolgens, in het ER, wordt de kleurstof omgezet in de ^{Ca2 +} gevoelige membraan doorlaatbare Ca ^{2 +} complex indicator (Fluo5N/Ca ^{2 +)} door de hoge esterase activiteit dan het vangen van de kleurstof in een hoge concentratie in het ER lumen ^{8 , 34.} De werkwijze is bijzonder nuttig voor ER calcium-afgifte te onderzoeken via de IiCR-wegen bijvoorbeeld via metabotrope, purinerge-of glutamaatreceptoren ^8,34 en ER calcium uitputting visualiseren via "lek kanalen" direct, bijvoorbeeld na blokkade van de SERCA ^{17 , 34.} Onze ervaring de lage affiniteit Ca ^{2 +-indicator} Fluo5N-AM is momenteel de best beschikbare indicator om te gebruiken met de TED kleurstof laden strategie. Fluo5N-AM heeft een lage affiniteit voor Ca ^{2 +} (dissociatieconstante K _D ~ 90 uM, figuur 2), is vrijwel non-tl in zijn AM-vorm, maar biedt een hoge fluorescentie-emissie bij calcium. binding ^8,34. De Fluo5N/Ca ^{2 +} complex geëxciteerd kan worden met een standaard lichtbron van ~ 490 nm, wat overeenkomt met standaard kleurstoffen zoals FITC, Alexa 488 of eGFP. Cytosolische calcium signalen nauwelijks een concentratie in het lage uM range bereiken en worden derhalve nauwelijks gedetecteerd door Fluo5N in de cytosol ^35.

Om TED verbeteren, werden verschillende recombinante vector constructen ontwikkeld (figuur 3). Oorspronkelijk TED vectoren op basis van de coderende sequentie van CES2 (Refseq toegangsnummer NM_145603, CES2c) en best TED werking wordt waargenomen met stabiele expressie van CES constructen. Nieuwe TED vectoren drukken een kernelement van CES2 gefuseerd met de rode fluorescentie eiwit TagRFP-T2 ^36. Deze vectoren hebben het voordeel dat zij kunnen worden geïdentificeerd getransduceerde cellen en de rode fluorescentie als een interne controle voor de normalisatie van veranderingen in Fluo5N/Ca ^{2 +} fluorescentie. De rode fluorescentie biedt ook de mogelijkheid om de structurele verdeling van de ER en veranderingen in ER processen onder de stimulatiecondities visualiseren.

Protocol

Dit protocol introduceert TED toegepast op cellijnen, hippocampale neuronen en corticale gliacellen. TED prestaties best wanneer TED vectoren stabiel tot expressie gebracht, bijvoorbeeld door lentivirale vectoren. Een schematisch overzicht van de TED werkwijze wordt getoond in figuur 4. 1. Voorbereiding van Solutions De volgende oplossingen worden bereid voordat en kunnen worden opgeslagen zoals aangegeven. Wij gebruiken over het algemeen gesterili…

Representative Results

Dit protocol voorziet in een niet-verstorende benadering voor directe beeldvorming van gratis ER calcium. Lage affiniteit synthetische Ca2 + indicatoren worden vrijgegeven en gevangen in het ER lumen met behulp van een ER gerichte recombinante esterase enzymactiviteit. Betere belading van de Ca 2 +-indicator kleurstoffen aan het ER lumen maakt een directe en snelle beeldvorming van ER calcium winkel dynamiek. Celtypen voor TED De haalbaarheid v…

Discussion

De voor-en nadelen van de TED-methode zijn uitgebreid besproken in recente publicaties ^34,35. Vergeleken met andere werkwijzen die hierboven beschreven TED omzeilt het probleem te verstoren en perfuseren van de cellen. Bovendien, twee aspecten moeten worden benadrukt. Het beginsel van TED ER calcium imaging (1.) De gerichte expressie van actief carboxylesterase in het ER lumen met behulp van TED vector constructen en (2.) Rationeel en preferentiële afgifte van laag-affiniteit synthetische AM-esters of vereis…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine)	Tocris	0805
5′;-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate	Sigma	A26209-1G
B-27 supplement,50x	Invitrogen	17504-044
Carbamoylcholine chloride (Charbachol)	Sigma	C4382-1g
Cyclopiazonic acid (CPA)	Ascent scientific	Asc-300
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
DMEM with Glutamax	Invitrogen-Gibco	31966-047
Dulbecco’s PBS without Ca/Mg 1x	PAA	H15-002
Fetal calf serum	Invitrogen-Gibco	10270-106
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg	Invitrogen	F14204
Glutamate	Ascent scientific	Asc-049
Glutamax	Invitrogen	35050-038
Ham’s F12 nutrients mixture	Invitrogen-Gibco	21765-029
Hank’s BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS	PAA Laboratories	H15-010
Horse serum	SHD3250YK	Linearis
Ionomycin Ca2+ salt	Ascent scientific	Asc-116
murine EGF	PreproTech	315-09
N2 supplement 100x	Invitrogen	17502-048
Neurobasal medium	Invitrogen-Gibco	21103-049
Pluronic F127, low UV absorbance,2g	Invitrogen	P6867
Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN	Sigma	P8638
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma	P7280
Poly-L-Lysin	Sigma	P2636
Thapsigargin	Calbiochem	586005-1mg
TryLE Express	Invitrogen	12605-028
Trypsin	Worthington	LS-003707
Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean)	Sigma	T6522
			Materials
Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635)	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector	Olympus		user-specific configuration
Heater controller TC-344B	Warner Instruments	64-0101	to control in line solution heater
NIH ImageJ software	WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997–2006
Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35	Olympus	N2709100
Objective: UPLFLN40XO	Olympus	N1478700
Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15	Olympus	N1480700
Perfusion chamber, inverse	custom-made
Perfusion chamber, RC-49FS	Warner Instruments	W4 64-1709
Perfusion tube: PT-49	Warner Instruments	64-1730	for perfusion
Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels)	Gilson	n.a.	perfusion pump
Single inline solution heater SH-27B	Warner Instruments	64-0102	controlled by heater controller
Suction tubes: ST3R	Warner Instruments	64-1407	for perfusion
Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel	Pecon	n.a.