Direct Imaging von Calcium ER mit Targeted-Esterase Induzierte Dye Loading (TED)

Summary

Gezielte-Esterase-induzierten Farbstoff Belastung (TED) unterstützt die Analyse der intrazellulären Kalzium-Speicher der Dynamik von Fluoreszenz-Bildgebung. Das Verfahren stützt sich auf Targeting eines rekombinanten Carboxylesterase zum Endoplasmatischen Retikulum (ER), wo es verbessert die lokale Entlarvung von synthetischen niedriger Affinität Ca^{2 +} Indikatorfarbstoffe in das ER-Lumen.

Abstract

Visualisierung Kalziumdynamik ist wichtig, die Rolle von Calcium in der Zellphysiologie zu verstehen. Um Kalzium Dynamik zu untersuchen, wurden synthetische fluoreszierenden Ca ^{2 +} Indikatoren populär geworden. Hier zeigen wir, TED (= gezielte-Esterase-induzierten Farbstoff Laden), eine Methode, um die Freisetzung von Ca ^{2 +} zu verbessern Indikatorfarbstoffe in das ER-Lumen verschiedener Zelltypen. Bisher wurde in TED-Zelllinien, Gliazellen und Neuronen in vitro verwendet. TED basiert auf effizienten, rekombinanten Targeting von einer hohen Aktivität Carboxylesterase dem ER-Lumen mit Vektor-Konstrukte, die ausdrückliche Carboxylesterasen (CES). Die neuesten TED Vektoren enthalten ein Kernelement CES2 fusioniert an ein rot fluoreszierendes Protein, wodurch gleichzeitige zweifarbige Bildgebung. Die Dynamik des freien Calcium in der ER sind in einer Farbe abgebildet, während die entsprechende ER Struktur erscheint in rot. Zu Beginn des Verfahrens werden die Zellen mit einem Lentivirus transduziert. Anschließend werden die infizierten Zellen einere auf Deckgläsern ausgesät, um endlich ermöglichen Live Cell Imaging. Dann lebenden Zellen werden mit dem Acetoxymethylester (AM-Ester) Form niedriger Affinität Ca ^{2 +} inkubiert Indikatoren, zum Beispiel Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, oder Mag-Fura2-AM. Die Esterase-Aktivität im ER spaltet hydrophoben Seitenketten vom AM Form des Ca ^{2 +-Indikator} und einem hydrophilen fluoreszierenden Farbstoff / Ca ^{2 +-Komplex} gebildet wird, und eingeschlossen in das ER-Lumen. Nach Farbstoffbeladung, werden die Zellen mit einem invertierten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop analysiert. Die Zellen werden kontinuierlich mit Ringer-ähnliche Lösungen perfundiert und die ER Calcium Dynamik direkt visualisiert Zeitraffer-Bildgebung. Calcium-Freisetzung aus dem ER wird durch eine Abnahme der Fluoreszenz-Intensität in Regionen von Interesse identifiziert, während das Nachfüllen der ER Calcium Speicher erzeugt eine Zunahme der Fluoreszenzintensität. Schließlich wird die Änderung in der Fluoreszenzintensität über die Zeit durch Berechnung der AF / F ₀ bestimmt.

Introduction

Um physiologischen Calcium Reaktionen des ER zu beheben, haben wir eine neue Strategie, um das Einfangen von synthetischen Calcium sensitiven Farbstoffen in die Notaufnahme zu verbessern. Das Verfahren ermöglicht die direkte, nicht-störende Echtzeit-Überwachung des freien ER Calcium in Gegenwart von extrazellulärem Calcium.

Funktion und Signalisierung von ER Calcium

Calcium-Signale werden in verschiedenen Zelltypen, zB Muskelzellen, Neuronen und Gliazellen und ihre Funktionen reichen von der Vermittlung Muskelkontraktion zu einer Beteiligung an der synaptischen Übertragung in Lernen und Gedächtnis ^1,2 gefunden. Änderungen im freien Calcium-Konzentration sind von hohem wissenschaftlichen Interesse, da Calcium in der Regulation der Gen-Transkription, Proliferation, neuronale Erregbarkeit, Zelltod und anderen Zelle Signalwege ^1-7 beteiligt ist. All diese zellulären Calcium-Signale sind funktional verbunden sind und dazu beitragen, Calcium intrazellulärestore Dynamik ^8-10.

Ein gemeinsames Merkmal aller Calcium-Signale ist der Fluss von Kalzium zwischen dem extrazellulären Raum, die Cytosol und Organellen, vor allem die ER und Mitochondrien. Dies bewirkt dynamische Änderungen der Calciumkonzentration innerhalb dieser Organellen, die von verschiedenen Signalkomponenten erfasst werden. Im Allgemeinen ist die Calcium-Konzentration in der ER zwischen 100 bis 800 um, in das Cytosol der Calcium-Konzentration in der Nähe von 100 nm und in den extrazellulären Raum die Konzentration etwa 1-2 mM. Dementsprechend gibt es eine hohe chemische Antriebskraft für Calcium Strömung zum Cytosol ^2,9,10.

Die am häufigsten untersuchten ER abgeleiteten Calcium Signale abhängig von der Stimulation der G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR), die dann aktiviert Phospholipase C (PLC). PLC erzeugt wiederum Inositol 1,4,5-triphosphat (IP ₃₎ ^1. Bei der Bindung von IP ₃ seiner receptor (IP _3-Rec, Abbildung 1) in der ER-Membran, werden Kalzium-Ionen aus dem ER-Lumen freigesetzt. Historisch gesehen, war IP _{3-vermittelte} Calcium-Freisetzung aus dem ER ersten – obwohl indirekt – gemessen in acinar Zellen der Bauchspeicheldrüse durch Streb et al 1983 ^11.. Diese Veröffentlichung vorgeschlagen erstmals eine Signalkaskade mit Acetylcholin, Phospholipase C und IP _3. Diese Art der Calcium-Freisetzung wird allgemein als IP _{3-induzierten} Calcium-Freisetzung (IICR) (Abbildung 1). Kinase-abhängige Aktivierung von Phospholipase C &ggr; durch Rezeptor-Tyrosinkinasen Verbindungen die Wirkung von Wachstumsfaktoren und neurotrophe Faktoren ER Calciumsignaltransduktion nach IP ₃ Erhebung ^12. Neben IICR kann Calciumerhöhung durch ionotropen Calcium Eintrag vermittelt werden, zum Beispiel über spannungsabhängigen Calcium-Kanäle (Ca _V) und anschließender Calcium-induzierten Calcium-Freisetzung (IKRK) von ryanodine reRezeptoren (RyR). IICR und CICR sind physiologisch Calcium-Shop-Eintrag (SOCE) verknüpft. SOCE umfasst die Wirkung von STIM (Stroma interagierende Molekül), die ein Sensor für ER Calcium-Freisetzung ist. STIM hat sich gezeigt, extrazellulären Calcium Eintrag durch transient receptor potential-Kanäle (Trp) ^13, Orai Kalziumkanäle ¹⁴ und sogar spannungsabhängigen Calcium-Kanäle ¹⁵ (Abbildung 1) zu stimulieren. Loss of ER Calcium wird dynamisch durch die Wirkung der sarco-endoplasmatischen Retikulum Calcium ATPase (SERCA), die aktiv Pumpen Calcium in die ER gerettet. Das Blockieren der SERCA mit Medikamenten wie thapsigargin enthüllt einen kontinuierlichen Verlust von Kalzium ER zum Zytosol. Das ER Calcium "Leck" wird durch ER intramembrane Porenkomplexe wie Sec61 Protein-Komplex ^16,17 (Abbildung 1) verursacht.

In 1998 veröffentlichte Berridge ein Modell, das "Neuron innerhalb eines Neurons model", which schlägt ein Prinzip physiologische Rolle des ER bei der Integration von neuronalen ^Calcium-5. Dieses Modell berücksichtigt die Existenz eines kontinuierlichen ER-Membran-System bildet eine intrazelluläre "Bild" des neuronalen Plasmamembran ^5. Diese binäre eukaryotischen Membran-System wurde behauptet, eine Grundvoraussetzung für zeitliche und räumliche Integration von schnellen und langsamen Calcium-Signale in Neuronen. Calcium-Signale auftreten, die entweder gleichzeitig oder anschließend in verschiedenen Stacheln oder Dendriten des gleichen Neurons zu der Zelle soma oder Kern über das ER, wo sie bis ^5,18 summiert verliehen. Dann kann ihre Summe haben Auswirkungen auf die Erregbarkeit des Neurons, die Regulierung der Gen-Transkription oder Integration von Signalkaskaden. Somit unterstützt die ER die Integration von Calcium-Signale. Eine Voraussetzung für dieses Konzept ist die Kontinuität des ER in einer einzigen Zelle, die durch mehrere Studien in Anspruch genommen wurde und das hat zumindest für somato-d erwiesenendritic Bereichen und kurze Strecke axonalen Projektionen ^19-21. Ob es ER Kontinuität innerhalb langen axonalen Projektionen ist eine Angelegenheit der Debatte.

Strategien, um den Fluss der freien Calcium über die ER-Membran zu messen

Calcium-Signale werden am häufigsten in das Cytosol ^22,23 überwacht. Es kann daher nicht leicht zu unterscheiden, ob ^{Ca2 +} in das Cytosol von extrazellulären oder intrazellulären Speichern ^6,24 fließenden werden. Um diese Beschränkung zu überwinden, wurden methodische Strategien zur direkten ER Calcium Imaging entwickelt. Zusammenfassend sind die folgenden Strategien: (1) ER-Protein gezielt gentechnisch-Indikatoren ^25-27 Protein-basierten Low-Affinität Ca ^{2 +-Indikatoren} verwenden die Biolumineszenz Protein GFP Äquorin oder in Kombination mit einem Calcium-sensitiven Proteins.. Diese gentechnisch veränderten Ca ^{2 +-Indikatoren} (GeCIS) kannder ER mit Hilfe eines Signalpeptids ausgerichtet sein und sich aktiv an der ER mit einem Aufbewahren und Abrufen Motiv gehalten. Gemeinsame ER Ca ^{2 +-Indikatoren} basieren auf der Cameleon-Prinzip und sind die Cameleon YC4.3 ^26,28; Cameleon Split YC7.3ER ²⁹ und ³⁰ Cameleon D1. (2) Direkter Esterase-basierte Farbstoff Laden von AM-Ester niedriger Affinität Ca ^{2 +} Indikatoren ^31,32. AM-Derivate der Indikatorfarbstoffe (Mag-Fura2-AM, Mag-Fluo4-AM oder Fluo5N-AM) gehen die biologischen Membranen in einem lipophilen, Calcium-und Kleinschreibung Zustand. Dann wird in das Cytosol und im ER freizugeben endogene Esterasen gespalten des AM-Estergruppe und die Ca ^{2 +-Indikator,} hinterlässt eine bestimmte Menge des aktiven Farbstoff im Cytosol und im ER. Daher ist dieser Ansatz unter den Bedingungen einer hohen Calcium-Konzentration in der ER nützlich, solange der cytosolischen Calciumkonzentration bleibt weit unter dem deNachweisgrenze der niedriger Affinität Indikatoren, insbesondere während der charakteristischen Calcium-Signale (zB nM bis niedrig uM). (3) AM-Ester Belastung in Kombination mit Plasmamembran Permeabilisierung ^32. Ein verbleibender zytosolischen Ca ^{2 +-Indikator} durch Plasmamembran Permeabilisierung mit geringen Mengen eines "mild" Reinigungsmittel (z. B. Saponin) in einem künstlichen intrazelluläre Puffer entfernt. Somit können die intrazellulären Membranen angeregt werden, zB mit IP ₃ in der intrazellulären Puffer direkt durch "Poren" in der Plasmamembran. (4) Dialyse des Cytosol unter Whole-Cell-Konfiguration und gleichzeitige Messungen von Ca ^{2 +} in das ER-Lumen und das Cytosol ^32,33. Zelle zuerst mit einer niedrigen Affinität Ca ^{2 +-Indikator} (zB Mag-Fura2 geladen AM, ratiometrischen, UV-Licht). Danach mit Hilfe eines Patch-Pipette, verbleibende cytosolic niedriger Affinität Ca ^{2 +-Indikator} aus dem Cytosol mit einem Puffer, der eine hohe Affinität Ca ^{2 +-Indikator} (zB Fluo-3, sichtbares Licht) dialysiert. Diese Strategie ermöglicht die gleichzeitige Aufnahme von zytosolischen und ER abgeleiteten Signale. (5) Gezielte-Esterase-induzierte Farbstoffbeladung ^8,34. A Carboxylesterase (CES) mit dem Lumen des ER gezielte und bietet eine hohe Esterase-Aktivität für eine effiziente Abfangen des AM-Ester Form niedriger Affinität Ca ^{2 +-Indikatoren.}

Gezielte-Esterase-induzierten Farbstoff Belastung (TED)

Zur Verbesserung der Ausrichtung der niedriger Affinität Ca ^{2 +} Indikatoren zur ER-Lumen, wurde TED entwickelt. TED erfordert die Überexpression eines ER gezielte Maus Carboxylesterase (CES2) (Abbildung 2), die über Expressionskonstrukte erreicht wird. Zellen, die ein rekombinantes CES-Konstrukt mit dem AM-Ester Form eines Calcium inkubiertIndikator-Farbstoff (Fluo5N-AM, Abbildung 2). Dann wird in dem ER wird der Farbstoff auf die Ca ^{2 +} umgewandeltes empfindlich, undurchlässigen Membran Ca ^{2 +-Indikator-Komplex} (Fluo5N/Ca ^{2 +)} durch die hohe Esterase daher Einfangen der Farbstoff in einer hohen Konzentration in der ER-Lumen ^{8 , 34.} Die Methode ist besonders nützlich, um ER Calcium-Freisetzung über die IICR-Bahnen zum Beispiel untersuchen, über metabotropic, purinergen-oder Glutamat-Rezeptoren ^8,34 und ER Calciumentzug visualisieren über "Leck-Kanäle" direkt, zum Beispiel nach Blockade der SERCA ^{17 , 34.} Um unsere Erfahrungen die Low-Affinität Ca ^{2 +-Indikator} Fluo5N-AM ist derzeit die beste verfügbare Indikator mit dem TED Farbstoffbeladung Strategie zu verwenden. Fluo5N-AM hat eine geringe Affinität für Ca ^{2 +} (Dissoziationskonstante K _D ~ 90 pM, Abbildung 2), ist fast nicht fluoreszierenden in seine AM-Form, sondern bietet eine hohe Fluoreszenzemission auf Calcium Bindung ^8,34. Die Fluo5N/Ca ^{2 +-Komplex} mit einer Standard-Lichtquelle von ~ 490 nm, die über die normalen Farbstoffen wie FITC, Alexa 488 oder eGFP entspricht angeregt werden. Cytosolic Calcium-Signale kaum erreichen eine Konzentration in den niedrigen pM-Bereich und werden daher kaum von Fluo5N im Cytosol ³⁵ erkannt.

Um die TED Leistung zu verbessern, wurden mehrere rekombinanten Vektor-Konstrukte entwickelt (Abbildung 3). Ursprünglich ist TED Vektoren auf der kodierenden Sequenz des CES2 (Refseq Zugangsnummer NM_145603, CES2c) und am besten TED Leistung bezogen mit stabilen Expression CES Konstrukte beobachtet. New TED Vektoren exprimieren ein Kernelement CES2 fusioniert mit dem roten fluoreszierenden Proteins TagRFP-T2 ^36. Diese Vektoren haben den Vorteil, dass sie verwendet werden, um zu identifizieren transduzierten Zellen und die rote Fluoreszenz als interne Kontrolle für die Normalisierung der Veränderungen in Fluo5N/Ca ² verwenden werden ⁺ Fluoreszenz. Die rote Fluoreszenz bietet auch die Möglichkeit, die strukturellen Verteilung der ER und ER Änderungen in Dynamik unter Stimulationsbedingungen visualisieren.

Protocol

Dieses Protokoll stellt TED angewendet, um Zelllinien, Neuronen im Hippocampus und kortikalen Gliazellen. TED Leistung ist am besten, wenn TED Vektoren sind stabil exprimiert, zum Beispiel durch lentivirale Vektoren. Ein schematischer Überblick über die TED Verfahren ist in Abbildung 4 dargestellt. 1. Herstellung von Lösungen Die folgenden Lösungen werden vor Beginn hergestellt und gelagert werden können, wie angegeben. Wir verwenden in der Re…

Representative Results

Dieses Protokoll stellt eine unterbrechungsfreie Ansatz für die direkte Bildgebung der freien ER Calcium. Low-Affinität synthetischen Ca 2 + Indikatoren gelöst und eingeschlossen in das ER-Lumen mit Hilfe eines ER gezielt rekombinanten Esterase Enzymaktivität. Verbesserte Belastung der Ca 2 +-Indikator Farbstoffe zum ER-Lumen ermöglicht eine direkte und schnelle Darstellung von ER Kalzium-Speicher der Dynamik. Zelltypen für TED Die Durchf…

Discussion

Die Vor-und Nachteile des TED Verfahren wurden ausgiebig in den letzten Publikationen ^34,35 diskutiert. Im Vergleich zu anderen oben beschriebenen Verfahren umgeht das Problem der TED zu stören und Perfusion der Zellen. Darüber hinaus müssen zwei Aspekte hervorgehoben werden. Das Prinzip der TED für ER Calcium Imaging erfordert (1.) Die gezielte Expression eines aktiven Carboxylesterase in das ER-Lumen mit Hilfe von TED Vektor-Konstrukte und (2.) Die effiziente und bevorzugte Freisetzung von niedriger Aff…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine)	Tocris	0805
5′;-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate	Sigma	A26209-1G
B-27 supplement,50x	Invitrogen	17504-044
Carbamoylcholine chloride (Charbachol)	Sigma	C4382-1g
Cyclopiazonic acid (CPA)	Ascent scientific	Asc-300
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
DMEM with Glutamax	Invitrogen-Gibco	31966-047
Dulbecco’s PBS without Ca/Mg 1x	PAA	H15-002
Fetal calf serum	Invitrogen-Gibco	10270-106
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg	Invitrogen	F14204
Glutamate	Ascent scientific	Asc-049
Glutamax	Invitrogen	35050-038
Ham’s F12 nutrients mixture	Invitrogen-Gibco	21765-029
Hank’s BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS	PAA Laboratories	H15-010
Horse serum	SHD3250YK	Linearis
Ionomycin Ca2+ salt	Ascent scientific	Asc-116
murine EGF	PreproTech	315-09
N2 supplement 100x	Invitrogen	17502-048
Neurobasal medium	Invitrogen-Gibco	21103-049
Pluronic F127, low UV absorbance,2g	Invitrogen	P6867
Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN	Sigma	P8638
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma	P7280
Poly-L-Lysin	Sigma	P2636
Thapsigargin	Calbiochem	586005-1mg
TryLE Express	Invitrogen	12605-028
Trypsin	Worthington	LS-003707
Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean)	Sigma	T6522
			Materials
Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635)	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector	Olympus		user-specific configuration
Heater controller TC-344B	Warner Instruments	64-0101	to control in line solution heater
NIH ImageJ software	WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997–2006
Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35	Olympus	N2709100
Objective: UPLFLN40XO	Olympus	N1478700
Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15	Olympus	N1480700
Perfusion chamber, inverse	custom-made
Perfusion chamber, RC-49FS	Warner Instruments	W4 64-1709
Perfusion tube: PT-49	Warner Instruments	64-1730	for perfusion
Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels)	Gilson	n.a.	perfusion pump
Single inline solution heater SH-27B	Warner Instruments	64-0102	controlled by heater controller
Suction tubes: ST3R	Warner Instruments	64-1407	for perfusion
Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel	Pecon	n.a.