Imaging diretta di calcio ER con Targeted-esterasi Induced Loading Dye (TED)

Summary

Mirata-esterasi indotta colorante di caricamento (TED) supporta l'analisi delle dinamiche di calcio intracellulare negozio di imaging di fluorescenza. Il metodo basa sul targeting di un carbossilesterasi ricombinante al reticolo endoplasmatico (ER), dove migliora la smascheramento locale di sintetico a bassa affinità Ca^{2 +} Indicatore di coloranti in ER lumen.

Abstract

Visualizzazione delle dinamiche di calcio è importante per capire il ruolo del calcio nella fisiologia cellulare. Per esaminare le dinamiche del calcio, fluorescenti Ca ^{2 +} indictors sintetici sono diventati popolari. Qui mostriamo TED (= colorante carico mirato-esterasi indotto), un metodo per migliorare il rilascio di Ca ^{2 +} pigmenti indicatori nel lume ER di tipi cellulari. Ad oggi, TED è stato utilizzato in linee cellulari, cellule gliali e neuroni in vitro. Basi TED su efficiente, ricombinante di mira di un'attività ad alto carbossilesterasi al lume ER utilizzando vettori costrutti che esprimono carbossilesterasi (CES). Le ultime vettori TED contengono un elemento centrale della CES2 fuso ad una proteina fluorescente rossa, consentendo in tal modo l'imaging simultaneo a due colori. La dinamica del calcio libero in ER vengono esposte in un unico colore, mentre la corrispondente struttura di ER appare in rosso. All'inizio del procedimento, le cellule vengono trasdotte con un lentivirus. Successivamente, le cellule infette ari seminati su vetrini per consentire finalmente l'imaging cellulare dal vivo. Poi, le cellule viventi sono incubate con l'estere acetossimetil (AM-estere) sotto forma di bassa affinità Ca ^{2 +} indicatori, per esempio Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, o Mag-Fura2-AM. L'attività esterasi nei unirà ER off catene laterali idrofobiche dal modulo AM del ⁺ indicatore Ca ² e una idrofila colorante fluorescente / Ca ^{2 +} complesso è formato e intrappolato in ER lumen. Dopo il colorante di caricamento, le cellule vengono analizzate con un microscopio confocale a scansione laser invertito. Le cellule sono continuamente perfusi con soluzioni di Ringer-like e le dinamiche del calcio ER sono direttamente visualizzati da time-lapse imaging. Rilascio del calcio dal RE è identificato da una diminuzione della intensità di fluorescenza in regioni di interesse, mentre il riempimento del negozio calcio ER produce un aumento di intensità di fluorescenza. Infine, la variazione di intensità fluorescente nel tempo è determinata mediante calcolo di Af / F _0.

Introduction

Al fine di risolvere le risposte fisiologiche di calcio del ER, abbiamo sviluppato una nuova strategia per migliorare la cattura di calcio sintetici coloranti sensibili al pronto soccorso. Il metodo consente la diretta, senza interruzioni monitoraggio in tempo reale di libero ER calcio in presenza di calcio extracellulare.

Funzione e segnalazione di calcio ER

Segnali di calcio si trovano in diversi tipi di cellule, ad esempio-cellule muscolari, neuroni e cellule gliali e la loro gamma di funzioni di mediazione contrazione muscolare ad un coinvolgimento nella trasmissione sinaptica nell'apprendimento e nella memoria di ^1,2. Cambiamenti nella concentrazione di calcio libero sono di grande interesse scientifico perché il calcio è coinvolto nella regolazione della trascrizione genica, la proliferazione cellulare, eccitabilità neuronale, la morte cellulare e altri eventi di segnalazione cellulare ^1-7. Tutti questi segnali di calcio cellulari sono funzionalmente collegati e contribuiscono a intracellulare di calcionegozio dinamiche ^8-10.

Una caratteristica comune a tutti i segnali di calcio è il flusso di calcio tra lo spazio extracellulare, citoplasma e organelli, soprattutto il ER e mitocondri. Questo provoca cambiamenti dinamici nella concentrazione di calcio all'interno di questi organelli, che vengono rilevate dai diversi componenti di segnalamento. In generale, la concentrazione di calcio nelle gamme ER tra 100 a 800 pM, nel citosol della concentrazione di calcio è quasi 100 nM, e nello spazio extracellulare la concentrazione è di circa 1-2 mm. Pertanto, vi è una forza motrice elevato chimica per flusso di calcio verso il citosol ^2,9,10.

I segnali di calcio ER-derivati ​​più comunemente studiate dipendono dalla stimolazione dei recettori accoppiati alla proteina G (GPCR), che poi attivano la fosfolipasi C (PLC). PLC a sua volta produce inositolo 1,4,5-trifosfato (IP ₃₎ ^1. In seguito al legame di IP ₃ alla sua receptor (IP _3-Rec, Figura 1) in ER-membrana, gli ioni calcio vengono rilasciati dal lume ER. Storicamente, IP rilascio di calcio _3-mediata dal pronto soccorso è stato il primo – anche se indirettamente – misurata in cellule pancreatiche acinose di Streb et al nel 1983 ^11.. Questa pubblicazione suggerito per la prima volta una cascata di segnalazione che coinvolge acetilcolina, fosfolipasi C, e IP _3. Questo modo di rilascio del calcio è generalmente definito IP rilascio del calcio _3-indotta (IiCR) (Figura 1). L'attivazione della chinasi-dipendente della fosfolipasi Cγ da recettore tirosin chinasi link l'azione di fattori di crescita e fattori neurotrofici di ER di calcio di segnalazione IP dopo ₃ elevazione ^12. Oltre a IiCR, elevazione di calcio può essere mediata da recettori ionotropici ingresso di calcio, per esempio attraverso i canali del calcio voltaggio-dipendenti (CA _V), e il successivo rilascio di calcio di calcio indotta (CICR) di ryanodine rirecettori (RyR). IiCR e CICR sono fisiologicamente legati al negozio-Entry operato di calcio (SOCE). SOCE comprende l'azione di STIM (stroma interagenti molecola), che è un sensore per il rilascio di calcio ER. STIM ha mostrato di stimolare l'ingresso di calcio extracellulare attraverso canali potenziali transitori recettore (Trp) ^13, Orai canali del calcio ¹⁴ e anche canali del calcio voltaggio-dipendenti ¹⁵ (Figura 1). Perdita di ER calcio viene salvato dinamicamente dall'azione del Sarco-reticolo endoplasmatico calcio ATPasi (SERCA), che attivamente pompe indietro calcio nel ER. Bloccare il SERCA con farmaci come thapsigargin svela una continua perdita di calcio ER al compartimento citosolico. Questo calcio ER "fuga" è causato da ER intramembrane complessi del poro come il complesso proteico Sec61 ^16,17 (figura 1).

Nel 1998, Berridge pubblicato un modello, il "neurone all'interno di un modello di neurone", which suggerisce un ruolo fisiologico principio della ER nell'integrazione di calcio neuronale ^5. Questo modello considera l'esistenza di un sistema a membrana ER continuo formando una "immagine" intracellulare della membrana plasmatica neuronale ^5. Questo sistema a membrana eucariotica binario è stato affermato di essere un prerequisito fondamentale per l'integrazione temporale e spaziale dei segnali veloci e lenti di calcio nei neuroni. Segnali di calcio che si verificano sia in concomitanza o successivamente in diverse spine o dendriti del neurone stesso sono conferiti a soma o nucleo attraverso il pronto soccorso, dove vengono riassunte ^5,18 della cellula. Quindi, la loro somma può avere effetto sul l'eccitabilità del neurone, regolazione della trascrizione genica o l'integrazione di cascate di segnalazione. Così, l'ER sostiene l'integrazione dei segnali di calcio. Una condizione per questo concetto è la continuità della ER in una singola cella, che è stato rivendicato da diversi studi e che è stato dimostrato almeno per somato-daree endritic e breve distanza proiezioni assonali ^19-21. Che ci sia continuità ER entro lunghe proiezioni assonale è una questione di dibattito.

Strategie per misurare il flusso di calcio gratis su membrana ER

Segnali di calcio sono più frequentemente monitorati nel citosol ^22,23. Pertanto, non può essere distinto facilmente se Ca ^{2 +} fluisce nel citosol da extracellulare o da riserve intracellulari ^6,24. Per superare questa limitazione, sono state sviluppate strategie metodologiche per l'imaging diretto di calcio ER. In sintesi, le seguenti strategie da utilizzare sono: (1) ER-mirati geneticamente proteine ​​indicatori ^25-27 a base di proteine ​​a bassa affinità Ca ^{2 +} indicatori utilizzano la proteina bioluminescente aequorina o GFP in combinazione con una proteina di rilevamento. Calcio. Queste Ca ^{2 +} indicatori geneticamente (GeCIS) puòessere mirati al pronto soccorso con l'aiuto di un peptide segnale e sono tenute attivamente al pronto soccorso con una ritenzione e motivo recupero. Comune ER Ca ^{2 +} indicatori di base sul principio Cameleon e sono il Cameleon YC4.3 ^26,28; Cameleon spaccatura YC7.3ER ^29, e Cameleon D1 ^30. (2) colorante diretto carico esterasi a base di AM-estere a bassa affinità Ca ^{2 +} indicatori ^31,32. Dell'indicatore di coloranti (Mag-Fura2-AM, Mag-Fluo4-AM o Fluo5N-AM)-derivati ​​AM passare il membrane biologiche in una lipofila, Stato di calcio-insensitive. Poi, nel citosol, nonché in ER, esterasi endogene fendere del gruppo AM-estere e rilasciano l'indicatore di Ca ^{2 +,} lasciando una certa quantità di colorante attivo nel citosol e nel ER. Pertanto, questo approccio è utile in condizioni di una concentrazione elevata di calcio in ER finché la concentrazione di calcio citosolico rimane ben al di sotto delimite di protezione degli indicatori a bassa affinità, in particolare durante segnali di calcio caratteristici (per esempio nM a basse pM). (3) loading AM-estere in associazione con permeabilizzazione della membrana plasmatica ^32. Qualsiasi residuo ⁺ citosolico indicatore Ca ² viene rimosso mediante permeabilizzazione della membrana plasmatica con piccole quantità di un detergente "neutro" (ad es saponina) in un tampone intracellulare artificiale. Così, le membrane intracellulari possono essere stimolate, ad esempio con IP ₃ nel buffer intracellulare, direttamente attraverso "pori" nella membrana plasmatica. (4) Dialisi del citosol in configurazione whole-cell e misure simultanee di Ca ^{2 +} nel lume ER e il citosol ^32,33. Una cella viene prima caricato con una bassa affinità Ca ^{2 +} indicatore (ad esempio Mag-Fura2- AM, raziometrico, luce UV). In seguito, con l'aiuto di una pipetta di patch, qualsiasi residuo cytosolic Ca ⁺ indicatore a bassa affinità ² viene dializzato dal citosol con un tampone contenente un Ca ^{2 +} indicatore ad alta affinità (es. Fluo-3, luce visibile). Questa strategia consente la registrazione simultanea di segnali derivati ​​citosolici e ER. (5) Targeted-esterasi indotta colorante carico ^8,34. Un carbossilesterasi (CES) è mirato a lume del ER e fornisce una elevata attività di esterasi intrappolamento efficiente del modulo AM-estere di bassa affinità Ca ^{2 +} indicatori.

Mirata-esterasi indotta colorante di caricamento (TED)

Per migliorare il targeting di bassa affinità Ca ^{2 +} indicatori per l'ER lumen, TED è stato sviluppato. TED richiede la sovraespressione di un ER carbossilesterasi topo mirata (CES2) (Figura 2), che si ottiene tramite costrutti di espressione. Cellule esprimenti un CES-costrutto ricombinante vengono incubate con il modulo AM-estere di un calcio nelgnalazione colorante (Fluo5N-AM, la Figura 2). Poi, in ER, il colorante viene convertito al Ca ^{2 +} sensibile, membrana impermeabile Ca ^{2 +} indicatore complesso (Fluo5N/Ca ^{2 +)} dall'attività elevata esterasi, quindi intrappolando il colorante in una concentrazione elevata nel lume ER ^{8 , 34.} Il metodo è particolarmente utile per indagare ER calcio-release tramite i IiCR-percorsi per esempio tramite metabotropici purinergici-o glutammato recettori, ^8,34 e visualizzare ER deplezione di calcio attraverso "canali di perdite" direttamente, per esempio, dopo il blocco del SERCA ^{17 , 34.} Per la nostra esperienza la bassa affinità Ca ^{2 +} indicatore Fluo5N-AM è attualmente il miglior indicatore disponibile per l'utilizzo con la strategia di caricamento TED colorante. Fluo5N-AM ha una bassa affinità per il Ca ^{2 +} (costante di dissociazione K _D ~ 90 pM, Figura 2), è quasi non fluorescente nella sua AM-forma, ma fornisce alta emissione di fluorescenza upon calcium ^8,34 vincolante. Il Fluo5N/Ca ^{2 +} complesso può essere eccitato con una sorgente luminosa standard di ~ 490 nm, che corrisponde a coloranti standard come FITC, Alexa 488, o eGFP. Segnali di calcio citosolico raggiungono appena un concentrazione nell'intervallo pM bassa e sono quindi appena rilevati dal Fluo5N nel citosol ^35.

Per migliorare la prestazione TED, sono stati sviluppati diversi costrutti vettore ricombinante (Figura 3). In origine, vettori TED base alla sequenza codificante di CES2 (Refseq numero adesione NM_145603, CES2c) e migliori prestazioni TED si osserva con espressione stabile del CES costrutti. Nuovi TED vettori esprimono un elemento centrale della CES2 fusa alla proteina fluorescente rossa TagRFP-T2 ^36. Questi vettori hanno il vantaggio che possono essere utilizzati per identificare cellule trasdotte e di utilizzare la fluorescenza rossa come controllo interno per la normalizzazione dei cambiamenti in Fluo5N/Ca ^{2 +} fluorescenza. La fluorescenza rossa offre anche la possibilità di visualizzare la distribuzione strutturale del ER e cambiamenti nelle dinamiche ER in condizioni di stimolazione.

Protocol

Questo protocollo introduce TED applicata alle linee di cellule, neuroni ippocampali e cellule gliali corticali. TED performance è migliore quando vettori TED sono stabilmente espresse, ad esempio vettori lentivirali. Una panoramica schematica del metodo TED è mostrato in Figura 4. 1. Preparazione delle soluzioni Le seguenti soluzioni devono essere preparate prima di iniziare e possono essere conservati come indicato. Usiamo generalmente di vetro…

Representative Results

Questo protocollo fornisce un approccio non distruttivo per l'imaging diretto di libera ER calcio. Bassa affinità sintetica Ca 2 + indicatori vengono rilasciati e intrappolati nel lume ER con l'aiuto di un ER mirati, attività enzimatica esterasi ricombinante. Migliorata caricamento delle Ca 2 + indicatore coloranti al pronto soccorso lume consente una rappresentazione diretta e veloce di ER calcio negozio dinamiche. Tipi di cellule per TED <p class="jove_cont…

Discussion

I vantaggi e gli svantaggi del metodo di TED sono state ampiamente discusse in recenti pubblicazioni ^34,35. Rispetto ad altri metodi sopra descritti, TED elude il problema di interrompere e perfusione delle cellule. Inoltre, due aspetti hanno bisogno di essere sottolineato. Il principio di TED per ER calcium imaging richiede (1.) L'espressione mirata di un carbossilesterasi attiva nel lume ER con l'aiuto del TED costrutti vettoriali e (2.) Il rilascio efficiente e preferenziale di bassa affinità sint…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine)	Tocris	0805
5′;-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate	Sigma	A26209-1G
B-27 supplement,50x	Invitrogen	17504-044
Carbamoylcholine chloride (Charbachol)	Sigma	C4382-1g
Cyclopiazonic acid (CPA)	Ascent scientific	Asc-300
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
DMEM with Glutamax	Invitrogen-Gibco	31966-047
Dulbecco’s PBS without Ca/Mg 1x	PAA	H15-002
Fetal calf serum	Invitrogen-Gibco	10270-106
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg	Invitrogen	F14204
Glutamate	Ascent scientific	Asc-049
Glutamax	Invitrogen	35050-038
Ham’s F12 nutrients mixture	Invitrogen-Gibco	21765-029
Hank’s BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS	PAA Laboratories	H15-010
Horse serum	SHD3250YK	Linearis
Ionomycin Ca2+ salt	Ascent scientific	Asc-116
murine EGF	PreproTech	315-09
N2 supplement 100x	Invitrogen	17502-048
Neurobasal medium	Invitrogen-Gibco	21103-049
Pluronic F127, low UV absorbance,2g	Invitrogen	P6867
Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN	Sigma	P8638
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma	P7280
Poly-L-Lysin	Sigma	P2636
Thapsigargin	Calbiochem	586005-1mg
TryLE Express	Invitrogen	12605-028
Trypsin	Worthington	LS-003707
Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean)	Sigma	T6522
			Materials
Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635)	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector	Olympus		user-specific configuration
Heater controller TC-344B	Warner Instruments	64-0101	to control in line solution heater
NIH ImageJ software	WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997–2006
Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35	Olympus	N2709100
Objective: UPLFLN40XO	Olympus	N1478700
Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15	Olympus	N1480700
Perfusion chamber, inverse	custom-made
Perfusion chamber, RC-49FS	Warner Instruments	W4 64-1709
Perfusion tube: PT-49	Warner Instruments	64-1730	for perfusion
Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels)	Gilson	n.a.	perfusion pump
Single inline solution heater SH-27B	Warner Instruments	64-0102	controlled by heater controller
Suction tubes: ST3R	Warner Instruments	64-1407	for perfusion
Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel	Pecon	n.a.