대상 - 에스테르 가수 분해 효소와 ER 칼슘의 직접 이미징 유발 염료 로딩 (TED)
Summary
대상 – 에스테르 가수 분해 효소 유도 염료로드 (TED)는 형광 이미징에 의해 세포 내 칼슘 저장소 역학의 분석을 지원합니다. 방법은 합성 낮은 친화력 CA의 로컬 폭로을 향상 소포체 (ER)로 재조합 Carboxylesterase의 대상에 기지<sup> 2 +</supER 루멘>에 표시 염료.
Abstract
칼슘 역학의 시각화 세포 생리학에서 칼슘의 역할을 이해하는 것이 중요합니다. 칼슘 역학을 조사하기 위해, 합성 형광 칼슘 2 +의 indictors가 인기를 끌고있다. 여기에 우리가 TED (= 대상 – 에스테르 가수 분해 효소 유도 염료로드), 칼슘의 방출을 개선하는 방법을 보여 + 다른 세포 유형의 ER 루멘의 표시기 염료. 지금까지 TED는 세포 라인, glial 세포 및 생체 뉴런에 사용되었다. 벡터 구조를 사용하여 ER 루멘에 높은 carboxylesterase 활동의 대상으로 효율적인 재조합에 TED 기지가 표현 Carboxylesterases (CES). 최근 TED 벡터 따라서 동시에 두 색 이미징을 가능하게 빨간색 형광 단백질에 융합 CES2의 핵심 요소가 포함되어 있습니다. 해당 ER 구조가 빨간색으로 표시되는 동안 ER 무료 칼슘의 역학은 하나의 색상에서 몇 군데 있습니다. 프로 시저의 시작 부분에서, 세포 렌티 바이러스로 형질 있습니다. 그 후, 감염된 세포다시 마지막 라이브 셀 이미징을 사용하는 coverslips를에 놓는. 그런 다음, 살아있는 세포가 아세 톡시 메틸 에스테르 (AM-에스테르) 낮은 친화력 칼슘의 형태로 배양하는 + 지표, 예를 들어 Fluo5N-AM, 매기 – Fluo4-AM, 또는 매기 – Fura2-AM. 칼슘 2 + 지표 및 친수성 형광 염료 / CA 2 + 복합 AM 양식에서 소수성 측쇄 오프 응급실 클리브의 에스테르 가수 분해 효소 활동이 형성된 ER 루멘에 갇혀있다. 염료로드 후, 세포는 거꾸로 공 촛점 레이저 스캐닝 현미경에서 분석됩니다. 세포는 지속적으로 벨소리와 같은 솔루션을 관류와 ER의 칼슘 역학 시간 경과 영상으로 직접 시각화 수 있습니다. ER의 칼슘 저장소의 보충이 형광 강도의 증가를 생산하는 반면, ER에서 칼슘 방출은 관심 영역에서 형광 강도의 감소에 의해 식별됩니다. 마지막으로, 시간이 지남에 따라 형광 강도의 변화는 ΔF / F 0의 계산에 의해 결정됩니다.
Introduction
ER의 생리적 칼슘 반응을 해결하기 위해, 우리는 ER로 합성 칼슘에 민감한 염료의 트래핑을 개선하기 위해 새로운 전략을 개발했다. 이 방법은 세포 외 칼슘의 면전에서 무료 ER 칼슘의 직접, 무중단 실시간으로 모니터링 할 수 있습니다.
ER 칼슘의 기능 및 신호
칼슘 신호는 다른 세포 유형, 예를 들면 근육 세포, 뉴런과 학습과 기억 1,2에서 시냅스 전달에 관여로 근육 수축을 중재에서 glial 세포와 그 기능 범위에 있습니다. 칼슘은 유전자 전사, 세포 증식, 신경 흥분, 세포 죽음 및 이벤트 1-7 신호를 다른 세포의 조절에 관여되어 있기 때문에 무료로 칼슘 농도의 변화는 높은 과학적 관심이다. 이러한 모든 세포 칼슘 신호는 기능적으로 연결되어 있고 칼슘을 세포 내에 기여하는매장 역학 8-10.
모든 칼슘 신호 사이의 일반적인 기능은 세포 공간과 칼슘의 흐름, 세포질 및 세포 소기관, 주로 ER 및 미토콘드리아이다. 이 서로 다른 신호 구성 요소에 의해 감지되는 이러한 세포 소기관 내 칼슘 농도의 동적 변경을 발생합니다. 일반적으로 100-800 μM 사이 ER 범위에서 칼슘 농도가 세포질에 칼슘 농도에 가까운 100 nm의, 그리고 세포 공간에 농도가 1 ~ 2 밀리미터 정도입니다. 따라서, 세포질 2,9,10으로 칼슘의 흐름에 대한 높은 화학 원동력이있다.
가장 일반적으로 조사 ER-파생 된 칼슘 신호는 포스 C (PLC)를 활성화 G-단백질 결합 수용체 (GPCR)의 자극에 따라 달라집니다. 차례 PLC는 이노시톨 1,4,5-trisphosphate (IP 3) 1을 생산하고 있습니다. 그 REC에 IP 3의 바인딩에 따라eptor이 (IP 3 녹화, 그림 1) ER 막에 칼슘 이온은 ER 루멘에서 해제됩니다. 역사적으로, ER에서 IP 3 매개 칼슘 방출은 처음 – 비록 간접적 – Streb 등으로 포상 췌장 세포에서 측정 된 1983 십일인치. 이 책은 처음으로 제안 아세틸 콜린, 포스 C 및 IP 3를 포함하는 신호 폭포. 칼슘 방출이 방법은 일반적으로 IP 3에 의한 칼슘 방출 (IiCR) (그림 1)이라고합니다. 수용체 tyrosin 키나제 링크 IP 3 높이 12 후 신호 ER의 칼슘 성장 인자와 신경 성장 인자의 작용에 의해 포스의 Cγ의 키나제에 의존 활성화. IiCR뿐만 아니라, 칼슘 상승은 ryanodine 재에 의해 전압 게이트 칼슘 채널 (칼슘 V), 및 후속 칼슘에 의한 칼슘 방출 (CiCR)를 통해 예를 들어, ionotropic 칼슘 항목에 의해 중재 될 수있다ceptors (RYR). IiCR 및 CiCR은 생리 학적으로 매장 운영 칼슘 항목 (SOCE)에 연결되어 있습니다. SOCE는 ER의 칼슘 릴리스에 대한 센서 STIM (기질의 상호 작용 분자)의 활동을 포함한다. STIM은 일시적인 수용체 잠재적 인 채널 (Trp의) 13 Orai 칼슘 채널 14도 전압 게이트 칼슘 채널 15 (그림 1)를 통해 세포 칼슘 항목을 자극하기 위해 표시되었습니다. ER 칼슘의 손실은 동적 적극적으로 펌프 칼슘 다시 ER로 사코 – 소포체 칼슘 ATPase의 (SERCA)의 작용에 의해 구출된다. 같은 쌥시 가르 긴 등의 약물 SERCA를 차단하면 세포질 구획 ER 칼슘의 지속적인 손실을 발표했다. 이 ER 칼슘 "누수"은 Sec61 단백질 복합체 16,17 (그림 1) 응급실 intramembrane 기공 복합체에 의해 발생합니다.
1998 년 Berridge는 모델, "신경 세포 모델에서 신경", 어느 것이를 발표H는 신경 세포의 칼슘는 5 통합에서 ER의 원리 생리적 역할을 제안합니다. 이 모델은 신경 세포막 5의 세포 내 "이미지"를 형성하는 연속 ER 막 시스템의 존재를 고려합니다. 이 바이너리 진핵 세포 멤브레인 시스템은 뉴런 빠르고 느린 칼슘 신호의 시간적 및 공간적 통합을위한 기본 전제 조건으로 주장했다. 같은 신경 세포의 다른 쪽이 나 돌기의 병용 또는 이후에 하나 발생할 칼슘 신호는 세포의 세포체 또는 그들이 5-18을 표현하는 ER을 통해 핵을 수여한다. 그런 다음, 그 합은 신호 폭포의 유전자 전사 또는 통합의 신경 규제의 흥분에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, ER 칼슘 신호의 통합을 지원합니다. 이 개념에 대한 하나의 전제 조건은 여러 연구에 의해 주장되었으며 적어도 somato-D에 대한 입증 된 어느 하나의 세포에서 ER의 연속성이다endritic 지역과 가까운 거리에 축삭 돌기 19-21. 긴 축삭 돌기에서 ER 연속성이 있는지 여부는 논쟁의 문제입니다.
ER 막에 무료로 칼슘의 흐름을 측정하는 전략
칼슘 신호는 가장 자주 세포질 22,23으로 모니터링됩니다. 따라서, 그것은 쉽게 칼슘 2 + 세포에서 또는 6,24 세포 내 상점에서 세포질로 유입 여부를 구별 할 수 없습니다. 이 제한을 극복하기 위해, 직접 ER의 칼슘 이미징을위한 방법 론적 전략이 개발되었다. 요약하면, 다음과 같은 전략이 사용됩니다. (1) 유전자 조작 단백질 지표 25-27 단백질 기반의 낮은 친화력 칼슘 2 + 지표 칼슘 감지 단백질과 결합 된 발광 단백질 aequorin 또는 GFP를 사용하여 ER-대상. 이러한 유전자 조작 칼슘 2 + 지표 (GECIs)는 수신호 펩타이드의 도움으로 응급실을 대상으로 적극적으로 보존 및 검색 모티브를 사용하여 ER에 보관됩니다. 카멜레온 분할 YC7.3ER 29, 그리고 카멜레온의 D1 30, 그리고 카멜레온 원리에 대한 일반적인 ER 칼슘 2 + 지표베이스는 카멜레온 YC4.3 26,28입니다. AM-에스테르 낮은 친화력 칼슘 2 (2) 직접 에스테르 가수 분해 효소 기반의 염료 로딩 + 지표 31,32가. 표시기 염료 (크기 – Fura2-AM, 매기 – Fluo4-AM 또는 Fluo5N-AM) 파생 오전을 통과 친 유성, 칼슘 구분 상태에서 생체막. 그런 다음, 세포질뿐 아니라 ER에서, 내생 에스 테라 AM-에스테르 그룹의 다니엘과 세포질에 적극적으로 염료의 일정 금액 뒤에와 ER에두고, 칼슘 2 + 표시를 놓습니다. 세포질 칼슘 농도가 잘 드 아래에 남아 그러므로,이 방법은 오래 ER에서 높은 칼슘 농도 조건에서 유용하다특히 특징적인 칼슘 신호 (낮은 μM로 예를 들면 NM) 동안 낮은 선호도 지표의 방호 한계. 플라즈마 멤브레인 permeabilization 32와 함께 (3) AM-에스테르 로딩. 모든 나머지 세포질 칼슘 2 + 표시는 인공 세포 버퍼에 "중성"세제 (예 : 사포닌)의 소량의 플라즈마 멤브레인 permeabilization에 의해 제거됩니다. 따라서, 세포 세포막에 직접 세포막의 "구멍"을 통해 세포 버퍼에 IP 3에 예를 들어, 자극 할 수있다. (4) 칼슘의 전체 셀 구성 및 동시 측정에 따라 세포질의 투석 + ER 루멘 및 세포질 32,33 인치 세포가 먼저 낮은 친화력 칼슘 2 + 지표 (예를 들어 크기 – Fura2 – 함께로드됩니다 AM), 비례 UV 빛. 그 후, 패치 피펫, 남아있는 CYT의 도움으로osolic 낮은 친화력 칼슘 2 + 지표는 높은 친화력 칼슘 2 + 지표 (예를 들면 플루오-3, 가시 광선)를 포함하는 버퍼 세포질에서 dialysed 있습니다. 이 전략은 세포질과 ER 유도 신호의 동시 녹음을 할 수 있습니다. (5) 대상 – 에스테르 가수 분해 효소에 의한 염료 로딩 8,34. Carboxylesterase은 (CES) ER의 내강을 대상으로 낮은 친화력 칼슘 2 + 지표 AM-에스테르 형태로 효율적으로 트래핑 높은 에스테르 가수 분해 효소 활동을 제공합니다.
대상 – 에스테르 가수 분해 효소 유도 염료로드 (TED)
ER 루멘 낮은 친화력 칼슘 2 + 지표를 대상으로 개선하기 위해 TED가 개발되었다. TED는 식 구조를 통해 달성된다 ER 대상 마우스 carboxylesterase (CES2) (그림 2)의 발현을 필요로한다. 재조합 CES-구조를 표현 세포에서 칼슘의 AM-에스테르 양식을 배양하는식일 염료 (Fluo5N-AM, 그림 2). 그런 다음, ER에서, 염료 칼슘 2로 변환 + 민감한 막 투과성 칼슘 따라서 ER 루멘 8 높은 농도에서 염료를 트래핑 높은 에스테르 가수 분해 효소 활동에 의해 + 표시 복잡 (Fluo5N/Ca 2 +), 34. 방법은 SERCA 17의 봉쇄 한 후 예를 들어 직접 "누설 채널"을 통해 대사성, 퓨린 또는 글루타민산 염 수용체 8,34를 통해 인스턴스에 대한 IiCR – 경로를 통해 ER 칼슘 방출을 조사하고, ER의 칼슘 고갈을 시각화하는 것이 특히 유용합니다 34. 우리의 경험에 낮은 친화력 칼슘 2 + 지표 Fluo5N-AM 현재 TED 염료로드 전략을 사용하는 가장 좋은 가능한 지표입니다. Fluo5N-AM은 칼슘 2 +에 대한 낮은 친화력이 (해리 상수 K D ~ 90 μM, 그림 2), 거의 비 형광의 AM-형태이지만, calciu에 높은 형광 방출을 제공합니다M 바인딩 8,34. Fluo5N/Ca 2 + 단지는 같은 FITC, 알렉사 488, 또는 EGFP와 같은 표준 염료에 해당 ~ 490 ㎚의 표준 광원으로 흥분 할 수 있습니다. 세포질 칼슘 신호는 거의 낮은 μM 범위에서 농도에 도달하지 않으므로 거의 세포질 35 Fluo5N에 의해 감지됩니다.
TED의 성능을 향상시키기 위해 몇 가지 재조합 벡터의 구조는 (그림 3)을 개발 하였다. 원래 CES2의 코딩 서열 (Refseq의 기탁 번호 NM_145603, CES2c)과 최고의 TED의 성능에 따라 TED 벡터는 CES의 구조를 안정적으로 발현으로 관찰된다. 새로운 TED 벡터는 빨간색 형광 단백질 TagRFP-T2 36 융합 CES2의 핵심 요소를 표현한다. 이러한 벡터들은 세포를 형질 확인하고 Fluo5N/Ca 2의 변화의 정상화를위한 내부 통제로 적색 형광을 사용하는 데 사용할 수 있다는 장점을 가지고 + 형광. 빨간색 형광은 자극 조건 하에서 ER과 ER 역학의 변화의 구조적 분포를 시각화 할 수있는 가능성을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
TED 방법의 장점과 단점은 최근의 출판물 34,35에서 광범위하게 논의되었다. 위에서 설명한 다른 방법에 비해, TED는 세포를 방해하고 관류의 문제를 우회. 또한, 두 가지 측면이 강조 될 필요가있다. ER 칼슘 이미징을위한 TED의 원리는 TED 벡터 구조의 도움과 낮은 친화력 합성 AM-에스테르 (2). 효율적이고 특혜 릴리스 ER 루멘의 활성 carboxylesterase (1). 대상으로 표현해야합니다 ER 루멘 칼슘 염료…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG) BL567/3-1와 프리드리히 바우어 – 재단의 보조금에 의해 지원되었다. 우리 태그 – RFP-T2를 저희에게 제공하기 위해 캘리포니아 샌디에고 대학의 로저 Y. 첸 교수, 하워드 휴즈 의학 연구소의 연구소에 감사드립니다. 우리는 다행히도 우리에게 렌티 바이러스 플라스미드 FUGW를 제공하고 psPAX2/pMD2.G 데이비드 볼티모어, 캘리포니아 공과 대학교, 패서 디나, 그리고 디디에 Trono, 제네바, 제네바, 대학을 인정합니다.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| (S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine) | Tocris | 0805 | |
| 5′;-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate | Sigma | A26209-1G | |
| B-27 supplement,50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Carbamoylcholine chloride (Charbachol) | Sigma | C4382-1g | |
| Cyclopiazonic acid (CPA) | Ascent scientific | Asc-300 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM with Glutamax | Invitrogen-Gibco | 31966-047 | |
| Dulbecco’s PBS without Ca/Mg 1x | PAA | H15-002 | |
| Fetal calf serum | Invitrogen-Gibco | 10270-106 | |
| Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg | Invitrogen | F14204 | |
| Glutamate | Ascent scientific | Asc-049 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-038 | |
| Ham’s F12 nutrients mixture | Invitrogen-Gibco | 21765-029 | |
| Hank’s BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS | PAA Laboratories | H15-010 | |
| Horse serum | SHD3250YK | Linearis | |
| Ionomycin Ca2+ salt | Ascent scientific | Asc-116 | |
| murine EGF | PreproTech | 315-09 | |
| N2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen-Gibco | 21103-049 | |
| Pluronic F127, low UV absorbance,2g | Invitrogen | P6867 | |
| Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN | Sigma | P8638 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Poly-L-Lysin | Sigma | P2636 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005-1mg | |
| TryLE Express | Invitrogen | 12605-028 | |
| Trypsin | Worthington | LS-003707 | |
| Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean) | Sigma | T6522 | |
| Materials | |||
| Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81 | Olympus | user-specific configuration | |
| Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635) | Olympus | user-specific configuration | |
| Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector | Olympus | user-specific configuration | |
| Heater controller TC-344B | Warner Instruments | 64-0101 | to control in line solution heater |
| NIH ImageJ software | WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997–2006 | ||
| Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35 | Olympus | N2709100 | |
| Objective: UPLFLN40XO | Olympus | N1478700 | |
| Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15 | Olympus | N1480700 | |
| Perfusion chamber, inverse | custom-made | ||
| Perfusion chamber, RC-49FS | Warner Instruments | W4 64-1709 | |
| Perfusion tube: PT-49 | Warner Instruments | 64-1730 | for perfusion |
| Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels) | Gilson | n.a. | perfusion pump |
| Single inline solution heater SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | controlled by heater controller |
| Suction tubes: ST3R | Warner Instruments | 64-1407 | for perfusion |
| Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel | Pecon | n.a. |
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