Imagem direta de cálcio ER com Targeted-Esterase Induzida Dye Loading (TED)

Summary

Targeted-esterase induzida corante de carregamento (TED) suporta a análise da dinâmica intracelular de cálcio loja por imagens de fluorescência. O método baseia-se na segmentação de uma carboxilesterase recombinante para o retículo endoplasmático (ER), onde se melhora o desmascaramento do local sintético de baixa afinidade Ca^{2 +} Corantes indicador no lúmen ER.

Abstract

Visualização da dinâmica do cálcio é importante para entender o papel do cálcio na fisiologia celular. Para examinar a dinâmica de cálcio, Ca ^{2 +} indicadores fluorescentes sintéticos tornaram-se populares. Aqui demonstramos TED (= targeted-esterase induzida corante de carga), um método para melhorar a libertação de ^{Ca2 +} corantes indicadoras no lúmen do ER de diferentes tipos de células. Até à data, o TED foi utilizado em linhas de células, células gliais e neurónios, in vitro. TED sobre bases eficientes, recombinante alvo de uma atividade de alto carboxilesterase para o lúmen ER usando vetores construções que carboxilesterases rápidas (CES). Os últimos vectores TED contendo um elemento de núcleo de CES2 fundida com uma proteína fluorescente vermelha, permitindo assim imagiologia simultânea de duas cores. A dinâmica do cálcio livre na ER são gravadas em uma cor, enquanto a estrutura ER correspondente aparece em vermelho. No início do processo, as células foram transduzidas com um lentivírus. Posteriormente, as células infectadas are semeadas em lamínulas para finalmente permitir imagens de células vivas. Em seguida, as células vivas são incubadas com o éster acetoximetílico (AM-éster) forma de baixa afinidade Ca ^{2 +} indicadores, por exemplo Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, ou Mag-Fura2-AM. A actividade de esterase nos cliva fora do ER cadeias laterais hidrófobas da forma AM do indicador de Ca ^{2 +} e de um corante fluorescente / Ca ^{2 +} complexo hidrófilo é formado e preso no lúmen do ER. Depois de corante de carga, as células foram analisadas num microscópio confocal laser scanning invertido. As células são continuamente perfundido com soluções de Ringer-like e as dinâmicas ER cálcio são diretamente visualizados por imagem time-lapse. Libertação de cálcio a partir do ER é identificado por uma redução na intensidade de fluorescência em regiões de interesse, enquanto que o reenchimento da loja ER cálcio produz um aumento na intensidade de fluorescência. Finalmente, a mudança na intensidade de fluorescência ao longo do tempo é determinada pelo cálculo da Af / F _0.

Introduction

A fim de resolver as respostas fisiológicas de cálcio do ER, desenvolvemos uma nova estratégia para melhorar a retenção de corantes sensíveis cálcio sintéticos para o ER. O método permite o monitoramento em tempo real direto, sem interrupções de livre ER cálcio na presença de cálcio extracelular.

Função e sinalização de cálcio ER

Sinais de cálcio são encontradas em diferentes tipos de células, células musculares, por exemplo, neurónios e células gliais e a sua gama de funções de mediar a contração do músculo a um envolvimento na transmissão sináptica na aprendizagem e na memória ^1,2. As alterações na concentração de cálcio livre são de interesse científico porque o cálcio está envolvido na regulação da transcrição de genes, a proliferação celular, a excitabilidade neuronal, morte celular e outros eventos de sinalização celular ^1-7. Todos estes sinais de cálcio celulares estão funcionalmente ligados e contribuir para cálcio intracelularloja dinâmica ^8-10.

Uma característica comum a todos os sinais de cálcio é o fluxo de cálcio entre o espaço extracelular, o citosol e organelas, principalmente, o ER e mitocôndrias. Isto faz com que as alterações dinâmicas na concentração de cálcio dentro destes organelos, que são detectados pelos diferentes componentes de sinalização. Em geral, a concentração de cálcio em gamas de RE entre 100 a 800 | iM, no citosol da concentração de cálcio é de cerca de 100 nM, e no espaço extracelular, a concentração é de cerca de 1-2 mM. Assim, não existe uma força motriz maior para o fluxo químico cálcio para o citosol ^2,9,10.

Os sinais de cálcio ER derivados mais comumente investigados dependem da estimulação dos receptores acoplados à proteína G (GPCR), que, em seguida, activam a fosfolipase C (PLC). PLC em vez produz o inositol 1,4,5-trifosfato (IP ₃₎ ^1. Após a ligação de IP ₃ à sua conseptor (IP _3-Rec, Figura 1) na ER-membrana, os íons cálcio são liberados a partir do lúmen ER. Historicamente, a liberação de cálcio ₃ mediada IP do ER foi o primeiro – mesmo que indiretamente – medido em células pancreáticas acinares por Streb et al, em 1983, ^11.. Esta publicação sugeriu pela primeira vez que uma cascata de sinalização que envolvem a acetilcolina, a fosfolipase C e _IP3. Esta forma de libertação de cálcio é geralmente denominado libertação de cálcio induzida por IP ₃ (IiCR) (Figura 1). Ativação da quinase dependente de fosfolipase Cy por receptores tirosina quinases liga a ação de fatores de crescimento e fatores neurotróficos para ER cálcio sinalização após IP ₃ elevação ^12. Além IiCR, elevação de cálcio podem ser a entrada de cálcio mediada por receptores ionotrópicos, por exemplo através de canais de cálcio dependentes da voltagem (Ca _V), e subsequente libertação de cálcio induzida por cálcio (CICR) por re rianodinaceptors (RyR). IiCR e CICR são fisiologicamente ligado a entrada de cálcio loja operado (SOCE). SOCE inclui a ação do STIM (molécula interagindo estroma), que é um sensor para a liberação ER cálcio. STIM foi mostrada para estimular a entrada de cálcio extracelular através de canais de receptores transientes potenciais (Trp) ^13, Orai canais de cálcio de ¹⁴ e até mesmo dos canais de cálcio dependentes da voltagem ¹⁵ (Figura 1). Perda de ER cálcio é dinamicamente resgatado pela ação do Sarco-retículo endoplasmático cálcio ATPase (SERCA), que ativamente bombas de cálcio de volta para o ER. O bloqueio da SERCA com drogas tais como tapsigargina revela uma perda contínua de cálcio RE para o compartimento citosólico. Este requisito de cálcio "fuga" é causado por ER intramembrane complexos de poros, tais como o complexo de proteína de ^16,17 Sec61 (Figura 1).

Em 1998, Berridge publicou um modelo, o "neurônio dentro de um modelo de neurônio", which sugere um papel fisiológico princípio da ER na integração de cálcio neuronal ^5. Este modelo considera a existência de um sistema de membrana ER contínuo formando uma "imagem" intracelular da membrana plasmática neuronal ^5. Este sistema de membranas eucarióticas binário foi reivindicada a ser um pré-requisito básico para a integração temporal e espacial dos sinais de cálcio rápidas e lentas em neurônios. Sinais de cálcio que ocorrem ou concomitantemente ou posteriormente em diferentes espinhos ou dendritos de um mesmo neurônio são conferidos a soma ou núcleo através da ER, onde se resumem ^5,18 da célula. Então, a soma pode ter efeitos sobre a excitabilidade do neurônio, a regulação da transcrição do gene ou a integração de cascatas de sinalização. Assim, o ER suporta a integração de sinais de cálcio. Um pré-requisito para este conceito é a continuidade do ER de uma única célula, o que foi reivindicado em diversos estudos e que foi provado pelo menos para somato-dáreas endritic e curta distância projeções axonais ^19-21. Se há continuidade ER dentro projeções axonais longas é uma questão de debate.

Estratégias para medir o fluxo de cálcio livre sobre a membrana ER

Sinais de cálcio são mais frequentemente monitorados no citosol ^22,23. Portanto, não pode ser facilmente distinguida se Ca ^{2 +} a fluir para o citosol a partir extracelular ou de reservas intracelulares ^6,24. Para superar esta limitação, foram desenvolvidas estratégias metodológicas para a imagem latente de cálcio direto ER. Em resumo, são utilizadas as seguintes estratégias: (1) ER-alvo geneticamente modificadas indicadores de ^{proteína-25-27} de baixa afinidade de Ca ^{2 +} os indicadores baseados Proteína utilizar a proteína bioluminescente aequorina GFP ou em combinação com uma proteína. Sensível ao cálcio. Estes Ca ^{2 +} indicadores geneticamente modificados (Gecis) podeser orientada para o ER, com a ajuda de um péptido de sinal e são activamente mantido no ER e de retenção utilizando um padrão de recuperação. Comum ER Ca ^{2 +} indicadores de base no princípio da Cameleon e são o Cameleon YC4.3 ^26,28; Cameleon divisão YC7.3ER ^29, e Cameleon D1 ^30. (2) direto carregamento de AM-éster de baixa afinidade Ca ² tintura baseada em indicadores esterase ^{+ 31,32.} Dos corantes indicadoras (Mag-Fura2-AM, Mag-Fluo4-AM ou Fluo5N-AM) derivativos AM passar o membranas biológicas em um estado de cálcio-insensitive lipofílico. Em seguida, no citosol, bem como no ER, esterases endógenas de clivar o grupo de AM-éster e libertar o indicador de ^{Ca2 +,} deixando para trás uma certa quantidade de corante activa no citossol e no ER. Por conseguinte, esta abordagem é útil em condições de uma elevada concentração de cálcio no ER, enquanto a concentração de cálcio citosólico permanece bem inferior ao nível delimite de protecção dos indicadores de baixa afinidade, em particular durante os sinais característicos de cálcio (por exemplo, de baixo nM até uM). (3) Carga AM-éster, em combinação com a permeabilização da membrana do plasma ^32. Qualquer citosólica de ^{Ca2 +} indicador remanescente é removido por permeabilização da membrana do plasma com quantidades pequenas de um detergente "leve" (por exemplo, saponina) num tampão intracelular artificial. Assim, as membranas intracelulares podem ser estimuladas, por exemplo, com IP ₃ intracelular no tampão, directamente através de "poros" da membrana plasmática. (4) Diálise do citosol sob configuração de célula inteira e medições simultâneas de Ca ^{2 +} no lúmen ER e citosol ^32,33. Uma célula é carregado pela primeira vez com uma baixa afinidade Ca ^{2 +} indicador (por exemplo, Mag-Fura2- AM, raciométrica, UV-luz). Depois, com a ajuda de uma pipeta de remendo, qualquer cit remanescenteosolic baixa afinidade de Ca ^{2 +} indicador é dialisado para fora do citosol com um tampão contendo um indicador de ^{Ca2 +} de elevada afinidade (por exemplo, Fluo-3, luz visível). Esta estratégia permite a gravação simultânea de sinais derivados citosólicas e ER. (5) Targeted-esterase induzida corante de carga de ^8,34. Carboxilesterase (CES) está voltado para o lúmen do RE e proporciona uma elevada actividade de esterase de aprisionamento eficaz da forma de AM-éster de baixa afinidade de Ca ^{2 +} indicadores.

Targeted-esterase induzida corante de carregamento (TED)

Para melhorar o direcionamento de baixa afinidade de Ca ^{2 +} indicadores para o lúmen ER, TED foi desenvolvido. TED requer a superexpressão de uma carboxilesterase alvo rato ER (CES2) (Figura 2), o que é conseguido por meio de construções de expressão. As células que expressam uma construção recombinante CES-são incubadas com a forma de AM-éster de cálcio emcorante dicator (Fluo5N-AM, a Figura 2). Em seguida, no ER, o corante é convertido para o ^{Ca2 +} sensíveis, a membrana impermeável de Ca ^{2 +} complexo indicador (Fluo5N/Ca ^{2 +),} pela elevada actividade de esterase, aprisionando, por conseguinte, o corante numa concentração elevada no lúmen ER ^{8 , 34.} O método é especialmente útil para investigar ER-libertação de cálcio através dos IiCR-vias, por exemplo por meio de purinérgicos ou receptores de glutamato metabotrópicos, ^8,34 e visualizar a depleção de cálcio através da "ER" canais de vazamento, por exemplo, directamente após o bloqueio da ¹⁷ SERCA ^{, 34.} Para nossa experiência, a baixa afinidade Ca ^{2 +} indicador Fluo5N-AM é atualmente o melhor indicador disponível para usar com a estratégia de carregamento TED corante. Fluo5N-AM tem uma baixa afinidade pelo Ca ^{2 +} (constante de dissociação K _D ~ 90 mM, figura 2), é quase não-fluorescente em seu AM-forma, mas oferece emissão de fluorescência de alta sobre calciu^8,34 m de ligação. O Fluo5N/Ca ^{2 +} complexo pode ser excitado com uma fonte de luz padrão de ~ 490 nm, o que corresponde a corantes convencionais, tais como FITC, Alexa 488, ou eGFP. Sinais de cálcio citosólico dificilmente atingir uma concentração na gama uM baixo e são, portanto, apenas detectada por Fluo5N no citosol ^35.

Para melhorar o desempenho TED, várias construções de vectores recombinantes foram desenvolvidos (Figura 3). Originalmente, os vectores de TED baseados na sequência de codificação de CES2 (RefSeq número de acesso NM_145603, CES2c) e melhor desempenho TED é observado com a expressão estável de CES construtos. Novos vetores TED expressar um elemento central da CES2 fundido à proteína fluorescente vermelha TagRFP-T2 ^36. Estes vectores possuem a vantagem de que eles podem ser utilizados para identificar as células transduzidas e utilizar a fluorescência vermelha como um controlo interno para a normalização de alterações na Fluo5N/Ca ^{2 +} fluorescência. A fluorescência vermelha também oferece a possibilidade de visualizar a distribuição estrutural do ER e as alterações na dinâmica do ER sob condições de estimulação.

Protocol

Este protocolo apresenta a TED aplicada a linhas de células, neurónios do hipocampo e células da glia corticais. TED desempenho é melhor quando vetores TED são estavelmente expressa, por exemplo, lentivirais. Uma visão geral esquemática do método TED é mostrado na Figura 4. 1. Preparação das soluções As seguintes soluções devem ser preparadas antes de partida e pode ser armazenado tal como indicado. Nós usamos geralmente vidro ester…

Representative Results

Este protocolo fornece uma abordagem sem interrupções para a imagem direta de livre ER cálcio. Baixa afinidade sintético Ca2 + indicadores são libertados e preso no lúmen do ER, com a ajuda de um ER alvo, a actividade da enzima esterase recombinante. Melhoria carregamento dos Ca 2 + indicador de corantes para o lúmen ER permite que uma imagem direta e rápida de dinâmicas armazenam cálcio ER. Tipos de células para TED A viabilidade do…

Discussion

As vantagens e desvantagens do método TED foram amplamente discutidas em publicações recentes ^34,35. Em comparação com os outros métodos descritos acima, o TED contorna o problema da interrupção e perfundir as células. Além disso, dois aspectos precisam ser enfatizados. O princípio de TED para ER imagem requer cálcio (1.) A expressão de um alvo carboxilesterase activo no lúmen do ER, com a ajuda de TED construções de vectores e (2.) A libertação eficiente e preferencial de baixa afinidade si…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine)	Tocris	0805
5′;-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate	Sigma	A26209-1G
B-27 supplement,50x	Invitrogen	17504-044
Carbamoylcholine chloride (Charbachol)	Sigma	C4382-1g
Cyclopiazonic acid (CPA)	Ascent scientific	Asc-300
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
DMEM with Glutamax	Invitrogen-Gibco	31966-047
Dulbecco’s PBS without Ca/Mg 1x	PAA	H15-002
Fetal calf serum	Invitrogen-Gibco	10270-106
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg	Invitrogen	F14204
Glutamate	Ascent scientific	Asc-049
Glutamax	Invitrogen	35050-038
Ham’s F12 nutrients mixture	Invitrogen-Gibco	21765-029
Hank’s BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS	PAA Laboratories	H15-010
Horse serum	SHD3250YK	Linearis
Ionomycin Ca2+ salt	Ascent scientific	Asc-116
murine EGF	PreproTech	315-09
N2 supplement 100x	Invitrogen	17502-048
Neurobasal medium	Invitrogen-Gibco	21103-049
Pluronic F127, low UV absorbance,2g	Invitrogen	P6867
Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN	Sigma	P8638
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma	P7280
Poly-L-Lysin	Sigma	P2636
Thapsigargin	Calbiochem	586005-1mg
TryLE Express	Invitrogen	12605-028
Trypsin	Worthington	LS-003707
Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean)	Sigma	T6522
			Materials
Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635)	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector	Olympus		user-specific configuration
Heater controller TC-344B	Warner Instruments	64-0101	to control in line solution heater
NIH ImageJ software	WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997–2006
Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35	Olympus	N2709100
Objective: UPLFLN40XO	Olympus	N1478700
Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15	Olympus	N1480700
Perfusion chamber, inverse	custom-made
Perfusion chamber, RC-49FS	Warner Instruments	W4 64-1709
Perfusion tube: PT-49	Warner Instruments	64-1730	for perfusion
Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels)	Gilson	n.a.	perfusion pump
Single inline solution heater SH-27B	Warner Instruments	64-0102	controlled by heater controller
Suction tubes: ST3R	Warner Instruments	64-1407	for perfusion
Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel	Pecon	n.a.