Direkt avbildning av ER Kalcium med riktade-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Summary

Riktade-esteras inducerade färgämnesbelastning (TED) stödjer analys av intracellulära dynamik kalcium butik genom fluorescens avbildning. Metoden baserar på en inriktning av en rekombinant karboxylesteras till det endoplasmatiska retiklet (ER), där det förbättrar den lokala demaskera av syntetiskt låg affinitet Ca^{2 +} Indikatorfärgämnen i ER lumen.

Abstract

Visualisering av kalcium dynamik är viktigt att förstå betydelsen av kalcium i cellen fysiologi. För att undersöka kalcium dynamik, har syntetiska fluorescerande Ca ^{2 +} indikatorer blivit populär. Här visar vi TED (= riktade-esteras inducerade färgämnesbelastning), en metod för att förbättra frigörandet av Ca ^{2 +} indikatorfärgämnen i ER lumen hos olika celltyper. Hittills har TED används i cellinjer, gliaceller och nervceller in vitro. TED baser på effektiv, rekombinant inriktning av en hög karboxylesteras aktivitet till ER lumen med hjälp av vektor-konstruktioner som uttrycker Carboxylesterases (CES). De senaste TED vektorer innehåller en central del av CES2 sammansmält till ett rött fluorescerande protein, vilket möjliggör simultan två-färgbilder. Dynamiken i fritt kalcium i ER avbildas i en färg, medan motsvarande ER strukturen visas i rött. I början av förfarandet, celler omvandlas med en lentivirus. Därefter de infekterade cellerna enre ympades på täckglas att äntligen möjliggöra levande cell imaging. Därefter levande celler inkuberas med acetoximetylester (AM-ester) form av låg affinitet ^{Ca2 +} indikatorer, exempelvis Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, eller Mag-fura2-AM. Esterasaktiviteten i ER klyver utanför hydrofoba sidokedjor från AM formen av ^{Ca2 +-indikator} och en hydrofil fluorescerande färgämne / ^{Ca2 +} komplex bildas och fastnar i ER lumen. Efter färgämnesbelastning, cellerna analyseras på en inverterad konfokalt laserscanning mikroskop. Celler kontinuerligt perfusion med Ringer-liknande lösningar och ER kalcium dynamik är direkt visualiseras genom time-lapse avbildning. Kalcium frisättning från ER identifieras genom en minskning i fluorescensintensitet i regioner av intresse, medan påfyllning av ER kalcium butiken ger en ökning av fluorescensintensitet. Slutligen, är förändringen i fluorescerande intensitet över tiden bestäms genom beräkning av AF / F _0.

Introduction

För att lösa fysiologiska kalcium svaren från ER, utvecklade vi en ny strategi för att förbättra fångst av syntetiska kalcium känsliga färgämnen till ER. Metoden möjliggör direkta, icke-störande realtidsövervakning av fri ER kalcium i närvaro av extracellulärt kalcium.

Funktion och signalering av ER Kalcium

Kalcium-signaler finns i olika celltyper, t.ex. muskel-celler, neuroner och gliaceller och deras funktioner varierar från medla muskelkontraktion till ett engagemang i synaptisk transmission i inlärning och minne ^1,2. Förändringar i fritt kalcium koncentrationen är av hög vetenskaplig intresse eftersom kalcium är involverat i regleringen av genen transkription, celldelning, neuronala retbarhet, celldöd och andra cell signalering händelser ^1-7. Alla dessa cellulära kalcium signaler funktionellt anslutna och bidra till intracellulär kalciumlagra dynamik ^8-10.

Ett gemensamt drag hos alla kalcium signaler är flödet av kalcium mellan det extracellulära utrymmet, cytosolen och organeller, främst ER och mitokondrier. Detta orsakar dynamiska förändringar i kalciumkoncentrationen inom dessa organeller, som avkänns av olika signalsystem komponenter. I allmänhet kalciumkoncentrationen i ER varierar mellan 100 och 800 ^ M, i cytosolen kalciumkoncentrationen är nära till 100 nM och i det extracellulära utrymmet koncentrationen är cirka 1-2 mM. Följaktligen finns det en hög kemisk drivkraft för kalcium flöde mot cytosolen ^2,9,10.

De vanligast undersökta ER-härledda kalcium signaler beror på stimulering av G-proteinkopplade receptorer (GPCR), som sedan aktiverar fosfolipas C (PLC). PLC i sin tur producerar inositol 1,4,5-trifosfat _(IP3) ^1. Vid bindning av IP ₃ av sin receptor (IP _3-Rec, figur 1) i ER-membranet, kalciumjoner frigörs från ER lumen. Historiskt sett var IP _3-medierad kalciumfrisättning från ER först – även om indirekt – mätt i acinära bukspottkörtelceller från Streb et al 1983 ^11.. Denna publikation föreslås för första gången en signaleringskaskad involverar acetylkolin, fosfolipas C, och IP _3. Detta sätt att kalciumfrisättning generellt betecknas IP _3-inducerad kalciumfrisättning (IiCR) (Figur 1). Kinas-beroende aktivering av fosfolipas Cy genom receptortyrosinkinaser tyrosin länkar handlingen av tillväxtfaktorer och neurotrofiska faktorer till ER kalcium signalering efter IP ₃ höjd ^12. Förutom IiCR, kan kalcium höjd förmedlas genom jonotropisk kalcium posten, till exempel via spänningsstyrda kalciumkanaler (Ca _V), och efterföljande kalcium-inducerad kalcium frisättning (CICR) genom ryanodine receptors (Ryr). IiCR och CICR är fysiologiskt kopplade till affären-drivs kalcium Entry (SOCE). SOCE innefattar verkan av Stim (stroma interagerande molekyl), som är en sensor för ER kalciumfrisättning. Stim har visats stimulera extracellulärt kalcium inlägg via Transient Receptor Potential kanaler (Trp) ^13, Orai kalciumkanaler ¹⁴ och till och med spänningsstyrda kalciumkanaler ¹⁵ (Figur 1). Förlust av ER kalcium dynamiskt räddas genom inverkan av Sarco-endoplasmatiska nätverket kalcium ATPas (SERCA), som aktivt pumpar kalcium tillbaka till akuten. Blockering av SERCA med droger liksom thapsigargin lanserar en kontinuerlig förlust av ER kalcium till cytosola facket. Denna ER kalcium "läcka" är orsakad av ER-komplex intramembrane porstorlek såsom Sec61 proteinkomplexet ^16,17 (figur 1).

År 1998 publicerade Berridge en modell, den "neuron inom en neuron modell", which föreslår en princip fysiologisk roll för ER att integrera neuronala kalcium ^5. Denna modell anser att det finns ett kontinuerligt ER membran systemet bildar en intracellulär "bild" av den neuronala plasmamembranet ^5. Denna binära eukaryot membran system påstås vara en grundläggande förutsättning för tidsmässig och rumslig integration av snabba och långsamma kalcium signaler i nervceller. Kalcium signaler som uppträder antingen samtidigt eller senare i olika ryggar eller dendriter av samma neuron har tilldelats till cellens soma eller kärna via ER, där de summeras ^5,18. Då kan deras summa ha effekter på retbarhet av neuron, reglering av gentranskription eller integration av signalkaskader. Sålunda stöder ER integrationen av kalcium signaler. En förutsättning för detta koncept är kontinuiteten av ER i en enda cell, vilket har hävdats av flera studier och som har visat minst för somato-dendritic områden och korta avstånd axonal prognoser ^19-21. Huruvida det är ER kontinuitet inom långa axonal prognoser är en fråga för debatt.

Strategier för att mäta flödet av fritt kalcium över ER-membranet

Kalcium signaler oftast övervakas i cytosolen ^22,23. Därför kan det inte lätt särskiljas huruvida Ca ^{2 +} strömmar in i cytosolen från extracellulära eller från intracellulära förråd ^6,24. För att övervinna denna begränsning, har metodologiska strategier för direkt ER kalcium avbildning utvecklats. Sammanfattningsvis är följande strategier användas: (1) ER-riktade genmanipulerade protein-indikatorer ^25-27 Protein-baserade låg affinitet ^{Ca2 +} indikatorer använder bioluminescensprotein aequorin eller GFP i kombination med en kalciumavkännande protein.. Dessa genetiskt manipulerade ^{Ca2 +} indikatorer (GECIs) kanriktas till ER med hjälp av en signalpeptid och aktivt hålls i ER med hjälp av en kvarhållande och hämtning motiv. Gemensam ER Ca ^{2 +} indikatorer bas på Cameleon principen och är Cameleon YC4.3 ^26,28, Cameleon split YC7.3ER ^29, och Cameleon D1 ^30. (2) Direkt esterasalstrande baserad färgämne lastning av AM-ester med låg affinitet ^{Ca2 +} indikatorerna ^31,32. AM-derivat av indikatorfärgämnen (Mag-fura2-AM, Mag-Fluo4-AM eller Fluo5N-AM) passera biologiska membran i en lipofil, kalcium-okänsliga tillstånd. Sedan, i cytosolen liksom i ER, endogena esteraser spjälkar av AM-estergruppen och släpp Ca ^{2 +} indikator och lämnar efter sig en viss mängd aktiv färgämne i cytosolen och i ER. Därför är denna metod användbar under betingelser av en hög kalciumkoncentration i ER, så länge som den cytosoliska kalciumkoncentrationen stannar långt under deskydd gränsen för låg affinitet indikatorer, särskilt under karakteristiska kalcium signaler (t.ex. nM till låga iM). (3) AM-ester lastning i kombination med plasmamembranet permeabilization ^32. Eventuellt kvarvarande cytosoliskt Ca ^{2 +} indikator avlägsnas genom plasmamembranet permeabilisering med små mängder av en "mild" rengöringsmedel (t.ex. saponin) i en artificiell intracellulär buffert. Således kan de intracellulära membran stimuleras, t.ex. med IP ₃ i den intracellulära buffert, direkt via "porer" i plasmamembranet. (4) Dialys i cytosolen i hela cellkonfiguration och samtidiga mätningar av ^{Ca2 +} i ER lumen och cytosolen ^32,33. En cell laddas först med en låg affinitet Ca ^{2 +} indikator (t.ex. Mag-fura2- AM, kvotmetriska, UV-ljus). Efteråt, med hjälp av en patch pipett, eventuella kvarvarande cytosolic låg affinitet Ca ^{2 +} indikator dialyseras ut ur cytosolen med en buffert innehållande en hög affinitet Ca ^{2 +} indikator (t.ex. Fluo-3, synligt ljus). Denna strategi möjliggör samtidig inspelning av cytosolic och ER härledda signaler. (5) Riktad-esterasalstrande inducerad färgämnesbelastning ^8,34. En karboxylesteras (CES) är riktad mot lumen av ER och ger en hög esterasaktiviteten för effektiv infångning av AM-ester form av låg affinitet ^{Ca2 +} indikatorer.

Riktade-esteras inducerade färgämnesbelastning (TED)

För att förbättra inriktning av låg affinitet ^{Ca2 +} indikatorer till ER lumen, var TED utvecklades. TED kräver överuttryck av en målinriktad ER mus karboxylesteras (CES2) (Figur 2), vilket uppnås via expressionskonstruktioner. Celler som uttrycker en rekombinant CES-konstruktionen inkuberas med AM-ester form av en kalcium iIndikatorn färgämne (Fluo5N-AM, figur 2). Sedan, i ER, är färgämnet omvandlas till Ca ^{2 +} känslig, membran impermeabelt Ca ^{2 +} indikator komplex (Fluo5N/Ca ^{2 +)} av den höga esterasaktiviteten därför fånga färgämnet i en hög koncentration i ER lumen ^{8 , 34.} Metoden är speciellt användbar för att undersöka ER kalcium-frisättning via IiCR-banor för exempel via metabotropiska, purinerga-eller glutamat-receptorer ^8,34 och att visualisera ER kalcium utarmning via "Läcka kanaler" direkt, exempelvis efter blockad av SERCA ^{17 , 34.} Till vår erfarenhet med låg affinitet Ca ^{2 +} indikator Fluo5N-AM är för närvarande den bästa tillgängliga indikatorn för användning med TED färgämnesbelastning strategi. Fluo5N-AM har en låg affinitet för ^{Ca2 +} (dissociationskonstant K _D ~ 90 ^ M, figur 2), är nästan icke-fluorescerande i sin AM-formen, men ger hög fluorescensemission vid Calcium bindning ^8,34. Den Fluo5N/Ca ^{2 +} komplexet kan exciteras med en vanlig ljuskälla med ~ 490 nm, vilket motsvarar vanliga färgämnen såsom FITC, Alexa 488, eller EGFP. Cytosoliska kalcium signalerna når knappast en koncentration i det låga pM intervallet och är därför knappt detekteras genom Fluo5N i cytosolen ^35.

För att förbättra prestanda TED har flera rekombinanta vektorkonstruktioner utvecklade (Figur 3). Ursprungligen är TED vektorer baserade på den kodande sekvensen för CES2 (RefSeq accessionsnummer NM_145603, CES2c) och bästa TED prestanda observerades med stabilt uttryck av CES konstruktioner. Nya TED vektorer uttrycker en central del av CES2 sammansmält med röda fluorescerande protein TagRFP-T2 ^36. Dessa vektorer har den fördelen att de kan användas för att identifiera omvandlade celler och att använda röd fluorescens som en intern kontroll för normalisering av förändringar i Fluo5N/Ca ^{2 +} fluorescens. Den röda fluorescens erbjuder också möjligheten att visualisera den strukturella fördelningen av ER och förändringar i ER dynamik enligt stimulering förhållanden.

Protocol

Detta protokoll introducerar TED tillämpas på cellinjer, hippocampus nervceller och kortikala gliaceller. TED prestanda fungerar bäst när TED vektorer uttrycks stabilt, exempelvis genom lentivirusvektorer. En schematisk översikt av TED metod visas i figur 4. Ett. Beredning av lösningar Följande lösningar skall beredas innan och kan lagras som anges. Vi använder vanligtvis steriliserad glas och plastmaterial och autoklaveras vatten. <ol…

Representative Results

Detta protokoll ger en icke-störande metod för direkt avbildning av fri ER kalcium. Låg affinitet syntetisk Ca 2 + indikatorer släpps och fångade i ER lumen med hjälp av en riktad ER, rekombinant esteras enzymaktivitet. Förbättrad lastning av Ca2 + indikatorfärgämnen till ER lumen möjliggör en direkt och snabb avbildning av ER dynamik kalcium butik. Celltyper för TED Genomförbarheten av metoden har visat i de cellinjer BHK21, HEK2…

Discussion

Fördelarna och nackdelarna med TED metoden har diskuterats flitigt de senaste publikationerna ^34,35. Jämfört med andra metoder som beskrivs ovan, kringgår TED problemet att störa och perfusion av cellerna. Dessutom två aspekter måste understrykas. Principen om TED för ER kalcium avbildning kräver (1.) Den riktade uttryck för en aktiv karboxylesteras i ER lumen med hjälp av TED vektorkonstrukt och (2.) En effektiv och förmånlig frisättning av låg affinitet syntetiska AM-estrar av kalcium färgä…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine)	Tocris	0805
5′;-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate	Sigma	A26209-1G
B-27 supplement,50x	Invitrogen	17504-044
Carbamoylcholine chloride (Charbachol)	Sigma	C4382-1g
Cyclopiazonic acid (CPA)	Ascent scientific	Asc-300
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
DMEM with Glutamax	Invitrogen-Gibco	31966-047
Dulbecco’s PBS without Ca/Mg 1x	PAA	H15-002
Fetal calf serum	Invitrogen-Gibco	10270-106
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg	Invitrogen	F14204
Glutamate	Ascent scientific	Asc-049
Glutamax	Invitrogen	35050-038
Ham’s F12 nutrients mixture	Invitrogen-Gibco	21765-029
Hank’s BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS	PAA Laboratories	H15-010
Horse serum	SHD3250YK	Linearis
Ionomycin Ca2+ salt	Ascent scientific	Asc-116
murine EGF	PreproTech	315-09
N2 supplement 100x	Invitrogen	17502-048
Neurobasal medium	Invitrogen-Gibco	21103-049
Pluronic F127, low UV absorbance,2g	Invitrogen	P6867
Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN	Sigma	P8638
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma	P7280
Poly-L-Lysin	Sigma	P2636
Thapsigargin	Calbiochem	586005-1mg
TryLE Express	Invitrogen	12605-028
Trypsin	Worthington	LS-003707
Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean)	Sigma	T6522
			Materials
Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635)	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector	Olympus		user-specific configuration
Heater controller TC-344B	Warner Instruments	64-0101	to control in line solution heater
NIH ImageJ software	WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997–2006
Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35	Olympus	N2709100
Objective: UPLFLN40XO	Olympus	N1478700
Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15	Olympus	N1480700
Perfusion chamber, inverse	custom-made
Perfusion chamber, RC-49FS	Warner Instruments	W4 64-1709
Perfusion tube: PT-49	Warner Instruments	64-1730	for perfusion
Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels)	Gilson	n.a.	perfusion pump
Single inline solution heater SH-27B	Warner Instruments	64-0102	controlled by heater controller
Suction tubes: ST3R	Warner Instruments	64-1407	for perfusion
Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel	Pecon	n.a.