Hedefli-esteraz ile ER Kalsiyum Doğrudan Görüntüleme Kaynaklı Boya Yükleme (TED)
Summary
Hedefli-esteraz bağlı boya yükleme (TED) floresan görüntüleme ile hücre içi kalsiyum deposu dinamiklerinin analizini destekler. Yöntem sentetik düşük afinite Ca yerel maskesinin geliştirir endoplazmik retikulum (ER), bir rekombinant karboksilesteraz hedeflenmesi üs<sup> 2 +</supER lümeninde> göstergesi boyalar.
Abstract
Kalsiyum dinamikleri görselleştirme hücre fizyolojisi kalsiyum rolünü anlamak önemlidir. Kalsiyum dinamikleri incelemek için, sentetik floresan Ca 2 + göstergeleri, popüler olmuştur. Burada TED (= hedef-esteraz bağlı boya yükleme), Ca 2 serbest bırakılması geliştirmek için bir yöntem ortaya koymaktadır + farklı hücre tipleri ER lümeninde göstergesi boyalar. Bugüne kadar, TED hücre hatları, glial hücreler, in vitro ve de nöronlar kullanılmıştır. Vektör yapıları kullanarak ER lümen yüksek bir karboksilesteraz faaliyet hedefleyen etkin, rekombinant üzerinde TED üsleri olduğunu ifade karboksilesterazdan (CES). En son TED vektörleri böylece aynı anda iki-renkli görüntüleme sağlayan kırmızı floresan proteini kaynaşmış CES2 temel bir öğesi içerir. Ilgili ER yapısı kırmızı görünürken ER serbest kalsiyum dinamikleri, tek bir renkte görüntülü. Prosedürün başlangıcında, hücreler bir lentivirüs ile transduse edilmiştir. Daha sonra, enfekte olmuş hücreler,yeniden nihayet canlı hücre görüntüleme sağlamak için lamelleri numaralı seribaşı. Daha sonra, canlı hücrelerin asetoksimetil ester (AM-ester) düşük afinite Ca 2 formu inkübe edilir + göstergeleri, örneğin Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, veya Mag-Fura2-AM. Ca2 + göstergesi ve hidrofilik bir floresan boya / Ca 2 + kompleksi, AM formundan hidrofobik yan zincirler kapalı ER bölmektedir içinde esteraz oluşan ve ER lümeninde tutulur. Boya Yükleme işleminden sonra, hücreler, bir ters konfokal lazer tarama mikroskobu de analiz edilmiştir. Hücreler sürekli Zil benzeri çözümleri ile perfüze ve Acil kalsiyum dinamikleri zaman atlamalı görüntüleme doğrudan görsel vardır. ER kalsiyum deposunun dolum floresan bir artış üreten ise ER kalsiyum açıklaması, ilgi bölgelerinde floresan azalma ile tanımlanır. Son olarak, zaman içinde floresan yoğunluğundaki değişiklik kadar taşınmış / F 0 hesaplama ile belirlenmektedir.
Introduction
ER fizyolojik kalsiyum yanıtları çözmek için, biz ER içine sentetik kalsiyum hassas boyaların yakalama artırmak için yeni bir strateji geliştirdi. Bu yöntem hücre dışı kalsiyum varlığında serbest ER kalsiyum doğrudan, olmayan yıkıcı gerçek zamanlı izleme sağlar.
ER Kalsiyum fonksiyonu ve sinyal
Kalsiyum sinyalleri farklı hücre tipleri, örneğin kas hücreleri, nöronlar ve öğrenme ve hafıza 1,2 sinaptik iletim bir katılımı kas kasılması aracılık gelen glial hücreler ve işlevleri aralığında bulunur. Kalsiyum gen transkripsiyonu, hücre çoğalması, nöronal uyarılabilirliği, hücre ölümü ve olaylar 1-7 sinyalizasyon diğer hücre düzenlenmesinde yer almaktadır, çünkü serbest kalsiyum konsantrasyonunu değişiklikler yüksek bir bilimsel ilgi vardır. Bütün bu hücre içi kalsiyum sinyalleri işlevsel olarak bağlı ve hücre içi kalsiyum katkıda bulunmaktadırmağaza dinamikleri 8-10.
Tüm kalsiyum sinyalleri arasında ortak bir özelliği hücre dışı alan arasında kalsiyum akışını, sitoplazmada ve organeller, özellikle ER ve mitokondri olduğunu. Bu, farklı sinyal bileşenleri tarafından algılanır ve bu organellerin içinde kalsiyum konsantrasyonunda dinamik değişiklikler olur. Genel olarak, 100-800 uM arasındaki ER aralıkları içinde kalsiyum konsantrasyonu, sitoplazmada kalsiyum konsantrasyonu yaklaşık 100 nM, ve hücre dışı ortamda konsantrasyon 1-2 mm civarındadır. Buna göre, sitoplazmada 2,9,10 doğru kalsiyum akışı için yüksek bir kimyasal itici güç vardır.
En yaygın olarak incelenmiştir ER-türevi kalsiyum sinyaller daha sonra fosfolipaz C (PLC), aktive G-protein bağlı reseptörler (GPCR), uyarımı bağlıdır. Da PLC inositol 1,4,5-trisphosphate (IP 3) 1 üretir. Onun rec IP 3 bağlayıcı üzerineeptor (IP 3-Rec, Şekil 1) ER-membran, kalsiyum iyonları ER lümeninde salınır. Tarihsel olarak, ER IP 3-aracılı kalsiyum sürümü ilk – bile dolaylı – Streb ve arkadaşları tarafından asiner pankreatik hücrelerde ölçülen 1.983 11.. Bu yayın, ilk kez önerilen asetilkolin, fosfolipaz C ve IP 3 içeren bir sinyal akışında. Kalsiyum serbest Bu şekilde genellikle IP 3-bağlı kalsiyum sürümü (IiCR) (Şekil 1) olarak adlandırılır. Reseptör tirozin kinazlar, bağlantılar IP 3 yükseklik 12 sonra sinyal ER kalsiyum büyüme faktörleri ve nörotrofik faktörlerin etkisi ile fosfolipaz Cγ arasında kinaza bağımlı aktifleştirme. IiCR ek olarak, kalsiyum yüksekliği riyanodin Re, voltaj-bağımlı kalsiyum kanallarının (Ca V) ve daha sonra kalsiyum ile indüklenen kalsiyum tahliyesinin (CICR) ile, örneğin, iyonotropik kalsiyum girişini aracılık edilebilirreseptör (RYR). IiCR ve CICR fizyolojik mağaza ile çalışan kalsiyum girişi (Soce) ile bağlantılıdır. Soce ER kalsiyum serbest bırakılması için bir sensör STIM (stroma etkileşen molekül), bir işlem içerir. STIM geçici reseptör potansiyel bir kanal (Trp) 13, Orai kalsiyum kanalları 14 ve hatta voltaj kapılı kalsiyum kanalları 15 (Şekil 1) yoluyla hücre-dışı kalsiyum girişini teşvik ettiği gösterilmiştir. ER kalsiyum kaybı dinamik aktif pompalar kalsiyum geri ER içine Sarko-endoplazmik retikulum kalsiyum ATPaz (SERCA), bir eylem tarafından kurtarılır. Bu thapsigargin gibi ilaçlar ile SERCA Engelleme sitozolik bölmesine ER kalsiyum sürekli bir kaybı tanıttı. Bu ER kalsiyum "kaçak" gibi Sec61 protein kompleksi 16,17 (Şekil 1) olarak ER intramembrane gözenek kompleksleri neden olur.
1998 yılında, Berridge bir model, "bir nöron modeli içinde nöron", hangi yayınlandıh nöronal kalsiyum 5 entegre ER bir ilke fizyolojik rolünü göstermektedir. Bu model nöronal plazma zarı 5 bir hücre içi "görüntü" oluşturan sürekli ER membran sisteminin varlığını dikkate alır. Bu ikili ökaryotik membran sistemi nöronlarda hızlı ve yavaş kalsiyum sinyallerinin zamansal ve mekansal entegrasyonu için temel bir ön koşul olduğu iddia edildi. Aynı nöron farklı dikenler veya dendritler eş zamanlı veya daha sonra da meydana kalsiyum sinyalleri hücrenin soma ya da 5,18 toplanır ER, ile çekirdeğine veriliyor. Daha sonra, bunların toplamı sinyal şelaleden gen transkripsiyonu veya entegrasyon nöron, düzenleme heyecanlanma üzerinde etkileri olabilir. Bu nedenle, ER kalsiyum sinyallerinin birleştirilmesi destekler. Bu kavram için bir ön koşul çeşitli çalışmalar tarafından iddia edilmiştir ve en az somato-d kanıtlanmıştır ki tek bir hücre, içinde ER sürekliliği olanendritic alanları ve kısa bir mesafe aksonal projeksiyonlar 19-21. Uzun aksonal projeksiyonlar içinde ER süreklilik olup olmadığını tartışma meselesidir.
ER membran üzerinden ücretsiz kalsiyum akışını ölçmek için Stratejiler
Kalsiyum sinyalleri en sık sitoplazmada 22,23 izlenir. Bu nedenle, kolaylıkla hücre dışı Ca2 + veya 6,24 hücre içi mağazalarından sitozolüne akan olup olmadığını ayırt edilemez. Bu sınırlama üstesinden gelmek için, doğrudan ER kalsiyum görüntüleme için metodolojik stratejiler geliştirilmiştir. Özet olarak, aşağıdaki stratejileri kullanılmıştır:. (1) genetik olarak işlenmiş protein göstergeleri: 25-27 protein tabanlı, düşük afiniteli bir Ca2 + göstergeleri, bir kalsiyum algılama proteini ile kombinasyon halinde biyolüminesans proteini aequorin veya GFP kullanımı ER-hedefli. Bu genetik Ca 2 + göstergeleri (GeCIS) canBir sinyal peptidi yardımıyla ER hedeflenebilir ve aktif bir saklama ve geri çağırma motifi kullanılarak ER tutulur. Cameleon bölünmüş YC7.3ER 29 ve Cameleon D1 30 ve Cameleon ilkesine Ortak ER Ca 2 + göstergeleri baz Cameleon YC4.3 26,28 bulunmaktadır. AM-ester düşük afinite Ca 2 (2) Doğrudan esteraz tabanlı boya yükleme + göstergeleri 31,32. Gösterge boyaların (Mag-Fura2-AM, Mag-Fluo4-AM veya Fluo5N-AM)-türevleri AM geçmek bir lipofilik, kalsiyum-duyarsız durumda biyolojik membranlar. Daha sonra, sitoplazmada gibi ER, endojen esterazlar AM-ester grubunun yarılma ve sitoplazmada aktif olan boya belirli bir miktarda arkasında ve ER bırakarak, Ca2 + göstergesi bırakın. Sitozolik kalsiyum konsantrasyonu de de altında kalır Bu nedenle, bu yaklaşım sürece ER yüksek bir kalsiyum konsantrasyonu koşulları altında yararlıdırözellikle karakteristik kalsiyum sinyalleri (düşük mcM örneğin nM) sırasında düşük afinite göstergelerin koruması sınırı,. Plazma zarının geçirgenliği 32 ile birlikte (3) AM ester yükleme., Kalan sitosolik Ca2 + gösterge yapay bir hücre içi tampon içinde bir "hafif" deterjan (örneğin saponin) küçük miktarlarda bulunan plazma membran geçirgenliği ile çıkarılır. Bu nedenle, hücre içi zarlar doğrudan plazma zarında "gözenekler" yoluyla, hücre içi tampon IP 3 ile, örneğin, güdülenebilir. (4) Ca 2 tam hücre konfigürasyonu ve eş zamanlı ölçüm altında sitoplazmada Diyaliz + ER lümeni ve sitosol içinde 32,33. Bir hücre olanlar, düşük afiniteli bir Ca2 + göstergesi (örneğin, Mag-Fura2-ile yüklenir AM,), rasyometrik UV ışık. Daha sonra, bir yama pipet, herhangi bir geri kalan cyt yardımıylaosolic düşük afiniteli bir Ca2 + göstergesi Yüksek afiniteli bir Ca2 + göstergesi (örneğin, Flu-3, görünür ışık) ihtiva eden bir tampon maddesi ile sitoplazmada üzerinden dializ edilir. Bu strateji, sitosolik ve ER türetilen sinyallerin eş zamanlı kayıt sağlar. (5) Hedefli-esteraz bağlı boya yükleme 8,34. Bir karboksilesteraz (CES) ER lümenine hedefleyen ve düşük afinite Ca 2 + göstergelerin AM-ester formunun etkin yakalama için yüksek esteraz aktivite sağlar.
Hedefli-esteraz bağlı boya yükleme (TED)
ER lümen için düşük afinite Ca 2 + göstergelerin hedef artırmak için, TED geliştirilmiştir. TED ekspresyon yapıları ile elde edilir, bir ER hedeflenen fare karboksilesteraz (CES2) (Şekil 2), bir aşırı gerektirir. Yeniden birleştirici bir yapı CES-salgılayan hücrelerin bir kalsiyum AM-ester şekli ile inkübe edilirdicator boya (Fluo5N-AM, Şekil 2). Daha sonra, ER, boya Ca 2 + dönüştürülür duyarlı membran geçirgen Ca2 nedenle ER lümeninde 8 de yüksek bir konsantrasyon olarak, boya tutucu yüksek esteraz ile + göstergesi kompleksi (Fluo5N/Ca 2 +), , 34. Yöntem SERCA 17 abluka sonra örneğin doğrudan "kaçak kanalları", ile metabotropik, purinerjik-veya glutamat reseptörleri 8,34 ile örneğin IiCR-yollardan ER kalsiyum-serbest araştırmak ve ER kalsiyum tükenmesi görselleştirmek için özellikle yararlıdır , 34. Deneyimlerimizi için düşük afinite Ca 2 + göstergesi Fluo5N-AM şu anda TED boya yükleme stratejisi ile kullanmak için mevcut en iyi göstergesidir. Fluo5N-AM, Ca2 + için düşük bir afiniteye sahiptir (ayrışma sabiti Kd ~ 90 uM, Şekil 2), hemen hemen-floresan ile AM-formunda olduğu, ancak calciu üzerine yüksek floresans emisyon içerirm bağlayıcı 8,34. Fluo5N/Ca 2 + kompleksi gibi FITC, Alexa 488 veya eGFP gibi standart boyalar karşılık ~ 490 nm standart bir ışık kaynağı ile heyecanlı olabilir. Sitosolik kalsiyum sinyalleri hemen hemen düşük uM aralığında bir konsantrasyonuna ulaşmak ve bu ancak sitoplazmada Fluo5N 35 tarafından tespit edilir.
TED performansını artırmak için, birkaç rekombinant vektör yapıları (Şekil 3) geliştirilmiştir. Başlangıçta, CES2 kodlama dizisi (RefSeq katılım sayısı NM_145603, CES2c) ve en iyi TED performansa dayalı TED vektörler CES yapıları istikrarlı ifade ile görülmektedir. Yeni TED vektörler kırmızı floresan proteini TagRFP-T2 36 erimiş CES2 temel bir unsuru ifade eder. Bu vektörler hücrelere transduse tespit etmek ve Fluo5N/Ca 2 değişikliklerin normalizasyonu için bir iç kontrol olarak, kızıl flüoresans kullanmak için kullanılabilir olması avantajına sahiptir + floresan. Kırmızı floresan da stimülasyon koşullar altında ER ve ER dinamikleri değişikliklerin yapısal dağılımı görselleştirmek için imkan sunuyor.
Protocol
Representative Results
Discussion
TED yöntemin avantajları ve dezavantajları son yayınları 34,35 yaygın olarak tartışılmıştır. Yukarıda tarif edilen diğer yöntemleri ile karşılaştırıldığında, TED hücreleri bozan ve perfüze problemini önlediği. Ayrıca, iki açıdan vurgulanması gerekir. ER kalsiyum görüntüleme için TED prensibi TED vektör yapıları yardımıyla ve düşük afiniteli bir sentetik AM-esterlerin (2). Verimli ve tercihli serbest bırakılması ile ER lümeninde aktif karboksilesteraz bölgesinin …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) BL567/3-1 ve Friedrich-Baur-Stiftung hibe tarafından desteklenmiştir. Biz Tag-TTT-T2 bize sağlamak için Kaliforniya, San Diego Üniversitesi'nde Roger Y. Tsien, Howard Hughes Tıp Enstitüsü Laboratuvarları teşekkür etmek istiyorum. Biz çok şükür ki bize lentiviral plazmid FUGW sağlayan ve psPAX2/pMD2.G için David Baltimore, California Institute of Technology, Pasadena, ve Didier Trono, Cenevre, Cenevre, Üniversitesi kabul.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| (S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine) | Tocris | 0805 | |
| 5′;-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate | Sigma | A26209-1G | |
| B-27 supplement,50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Carbamoylcholine chloride (Charbachol) | Sigma | C4382-1g | |
| Cyclopiazonic acid (CPA) | Ascent scientific | Asc-300 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM with Glutamax | Invitrogen-Gibco | 31966-047 | |
| Dulbecco’s PBS without Ca/Mg 1x | PAA | H15-002 | |
| Fetal calf serum | Invitrogen-Gibco | 10270-106 | |
| Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg | Invitrogen | F14204 | |
| Glutamate | Ascent scientific | Asc-049 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-038 | |
| Ham’s F12 nutrients mixture | Invitrogen-Gibco | 21765-029 | |
| Hank’s BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS | PAA Laboratories | H15-010 | |
| Horse serum | SHD3250YK | Linearis | |
| Ionomycin Ca2+ salt | Ascent scientific | Asc-116 | |
| murine EGF | PreproTech | 315-09 | |
| N2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen-Gibco | 21103-049 | |
| Pluronic F127, low UV absorbance,2g | Invitrogen | P6867 | |
| Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN | Sigma | P8638 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Poly-L-Lysin | Sigma | P2636 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005-1mg | |
| TryLE Express | Invitrogen | 12605-028 | |
| Trypsin | Worthington | LS-003707 | |
| Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean) | Sigma | T6522 | |
| Materials | |||
| Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81 | Olympus | user-specific configuration | |
| Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635) | Olympus | user-specific configuration | |
| Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector | Olympus | user-specific configuration | |
| Heater controller TC-344B | Warner Instruments | 64-0101 | to control in line solution heater |
| NIH ImageJ software | WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997–2006 | ||
| Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35 | Olympus | N2709100 | |
| Objective: UPLFLN40XO | Olympus | N1478700 | |
| Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15 | Olympus | N1480700 | |
| Perfusion chamber, inverse | custom-made | ||
| Perfusion chamber, RC-49FS | Warner Instruments | W4 64-1709 | |
| Perfusion tube: PT-49 | Warner Instruments | 64-1730 | for perfusion |
| Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels) | Gilson | n.a. | perfusion pump |
| Single inline solution heater SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | controlled by heater controller |
| Suction tubes: ST3R | Warner Instruments | 64-1407 | for perfusion |
| Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel | Pecon | n.a. |
References
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 517-529 (2003).
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 11-21 (2000).
- Agulhon, C., et al. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
- Augustine, G. J., Santamaria, F., Tanaka, K. Local calcium signaling in neurons. Neuron. 40, 331-346 (2003).
- Berridge, M. J. Neuronal calcium signaling. Neuron. 21, 13-26 (1998).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73, 862-885 (2012).
- Neher, E., Sakaba, T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release. Neuron. 59, 861-872 (2008).
- Jaepel, J., Blum, R. Capturing ER calcium dynamics. European Journal of Cell Biology. 90, 613-619 (2011).
- Verkhratsky, A. Physiology and pathophysiology of the calcium store in the endoplasmic reticulum of neurons. Physiological Reviews. 85, 201-279 (2005).
- Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function. Cell Calcium. 38, 303-310 (2005).
- Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. Release of Ca2+ from a nonmitochondrial intracellular store in pancreatic acinar cells by inositol-1,4,5-trisphosphate. Nature. 306, 67-69 (1983).
- Choi, J. H., Ryu, S. H., Suh, P. G. On/off-regulation of phospholipase C-gamma 1-mediated signal transduction. Advances in Enzyme Regulation. 47, 104-116 (2007).
- Clapham, D. E. TRP channels as cellular sensors. Nature. 426, 517-524 (2003).
- Cahalan, M. D. STIMulating store-operated Ca(2+) entry. Nature Cell Biology. 11, 669-677 (2009).
- Soboloff, J., Madesh, M., Gill, D. L. Sensing cellular stress through STIM proteins. Nature Chemical Biology. 7, 488-492 (2011).
- Erdmann, F., et al. Interaction of calmodulin with Sec61alpha limits Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum. The EMBO Journal. 30, 17-31 (2011).
- Schäuble, N., et al. BiP-mediated closing of the Sec61 channel limits Ca(2+) leakage from the ER. The EMBO Journal. , (2012).
- Park, M. K., Choi, Y. M., Kang, Y. K., Petersen, O. H. The endoplasmic reticulum as an integrator of multiple dendritic events. The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 14, 68-77 (2008).
- Cooney, J. R., Hurlburt, J. L., Selig, D. K., Harris, K. M., Fiala, J. C. Endosomal compartments serve multiple hippocampal dendritic spines from a widespread rather than a local store of recycling membrane. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2215-2224 (2002).
- Holbro, N., Grunditz, A., Oertner, T. G. Differential distribution of endoplasmic reticulum controls metabotropic signaling and plasticity at hippocampal synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15055-15060 (2009).
- Terasaki, M., Slater, N. T., Fein, A., Schmidek, A., Reese, T. S. Continuous network of endoplasmic reticulum in cerebellar Purkinje neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7510-7514 (1994).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J. Vis. Exp. (23), e1067 (2009).
- Lang, S., Schäuble, N., Cavalie, A., Zimmermann, R. Live cell calcium imaging combined with siRNA mediated gene silencing identifies Ca(2)(+) leak channels in the ER membrane and their regulatory mechanisms. J. Vis. Exp. (53), e2730 (2011).
- Rudolf, R., Mongillo, M., Rizzuto, R., Pozzan, T. Looking forward to seeing calcium. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 579-586 (2003).
- Mank, M., Griesbeck, O. Genetically encoded calcium indicators. Chemical Reviews. 108, 1550-1564 (2008).
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
- Montero, M., et al. Monitoring dynamic changes in free Ca2+ concentration in the endoplasmic reticulum of intact cells. The EMBO Journal. 14, 5467-5475 (1995).
- Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications. The Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).
- Ishii, K., Hirose, K., Iino, M. Ca2+ shuttling between endoplasmic reticulum and mitochondria underlying Ca2+ oscillations. EMBO Reports. 7, 390-396 (2006).
- Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17404-17409 (2004).
- Hofer, A. M., Machen, T. E. Technique for in situ measurement of calcium in intracellular inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive stores using the fluorescent indicator mag-fura-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2598-2602 (1993).
- Solovyova, N., Verkhratsky, A. Monitoring of free calcium in the neuronal endoplasmic reticulum: an overview of modern approaches. Journal of Neuroscience Methods. 122, 1-12 (2002).
- Solovyova, N., Veselovsky, N., Toescu, E. C., Verkhratsky, A. Ca(2+) dynamics in the lumen of the endoplasmic reticulum in sensory neurons: direct visualization of Ca(2+)-induced Ca(2+) release triggered by physiological Ca(2+) entry. The EMBO Journal. 21, 622-630 (2002).
- Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum. Cell Calcium. 44, 386-399 (2008).
- Blum, R., Verkhratsky, A., Petersen, O. H. . Calcium imaging of intracellular organelles: endoplasmic reticulum. 43, (2010).
- Shaner, N. C., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. 5, 545-551 (2008).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295, 868-872 (2002).
- Zufferey, R., et al. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. Journal of Virology. 72, 9873-9880 (1998).
- Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15, 871-875 (1997).
- Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21960-21965 (2009).
- Blum, R., Petersen, O. H., Verkhratsky, A., Verkhratsky, A., Petersen, O. H. . Calcium measurement methods. Vol. Neuromethods 43 (Springer protocols), 147-167 (2010).
- Tian, L., et al. Selective esterase-ester pair for targeting small molecules with cellular specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4756-4761 (2012).
- Samtleben, S., Blum, R. Improved vectors for direct ER calcium imaging with targeted-estersase induced dye loading. , (2012).
