In vivo Messung der Maus Pulmonary Endothelial Surface Layer
Summary
Die endotheliale Glykokalyx / endothelial Oberflächenschicht ist ideal studiert mit Intravitalmikroskopie. Intravitalmikroskopie ist technisch anspruchsvoll in einem sich bewegenden Organ wie der Lunge. Wir zeigen, wie die gleichzeitige Hellfeld und Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, um Endotheloberfläche Schichtdicke in einem frei beweglichen abzuschätzen<em> In vivo</em> Maus Lunge.
Abstract
Die endotheliale Glykokalyx ist eine Schicht aus Proteoglycanen und zugehörige Glycosaminoglycane Auskleiden des Gefäßlumens. In vivo die Glykocalix hochhydratisierten ist, Bilden einer erheblichen endothelialen Oberflächenschicht (ESL), die zur Aufrechterhaltung der endothelialen Funktion beiträgt. Als die endotheliale Glykokalyx ist oft aberrante in vitro und ist während der normalen Gewebe Fixationstechniken verloren, benötigt Studie der ESL Verwendung von Intravitalmikroskopie. Um die beste Annäherung an die komplexen Physiologie des alveolären Mikrovaskulatur wird pulmonalen intravital Bildgebung ideal auf einem frei beweglichen Lungenkrebs durchgeführt. Diese Zubereitungen jedoch typischerweise unter umfangreichen Bewegungsartefakt. Wir zeigen, wie mit geschlossenem Brustkorb Intravitalmikroskopie einer frei beweglichen Mauslunge verwendet werden, um Glykocalix Integrität mittels ESL Ausschluss von fluoreszenzmarkierten hochmolekularen Dextrane aus der endothelialen Oberfläche zu messen. Diese Nichtwiedereinziehung chirurgische Technik, die benötigtgleichzeitige Hellfeld und Fluoreszenz-Bildgebung der Maus Lunge, ermöglicht Längs Beobachtung des subpleural Mikrovaskulatur ohne Beweise zu induzieren confounding Lungenschädigung.
Introduction
Die endotheliale Glykokalyx ist ein extrazelluläres Schicht aus Proteoglycanen und zugehörige Glycosaminoglycane Auskleiden der vaskulären Intima. In vivo die Glykocalix hochhydratisierten ist, Bilden einer Oberflächenschicht wesentlichen endothelialen (ESL), die eine Vielzahl von Funktionen einschließlich Endothelzellen Fluiddurchlässigkeit 1, Neutrophilen-Endothel reguliert Haftung 2 und die Mechanotransduktion von Fluid Scherbeanspruchung 3.
Historisch gesehen hat die Glykokalyx war underappreciated aufgrund seiner aberrance in kultivierten Zellpräparationen 4, 5 und seine Abbauprodukte während der üblichen Gewebefixierung und Verarbeitung 6. Der zunehmende Einsatz 7 von Intravitalmikroskopie (in vivo Mikroskopie, IVM) hat mit erhöhter wissenschaftliche Interesse an der Bedeutung der ESL auf vaskuläre Funktion bei Gesundheit und Krankheit zusammenfiel. Die ESL ist unsichtbar für Lichtmikroskopie und kann nicht einfach de beschriftbarvivo, da die Neigung der fluoreszierenden Glykokalyx-bindenden Lektine RBC Agglutination 8 und tödlichen Lungenembolien (unveröffentlichte Beobachtungen) verursachen. Mehrere indirekte Ansätze wurden daher entwickelt, um ESL Dicke (und durch Erweiterung, Glykokalyx Integrität) in unbewegten Gefäßbetten wie die cremasterica und mesenterialen microcirculations abzuleiten. Diese Techniken umfassen die Messung der Differenzen der zirkulierenden Mikropartikel Geschwindigkeit als eine Funktion des Abstands von der endothelialen Membran (Mikropartikel Bild velocimetry 9) sowie die Messung der Ausschluss von sperrigen, fluoreszenzmarkierten vaskulären Markern (zB Dextrane) von der endothelialen Oberfläche (Dextran Exklusionstechnik 10, 11). Von diesen Techniken ist nur Dextran Ausschluss fähig Schätzen ESL Dicke aus Messungen an einem einzigen Zeitpunkt hergestellt. Durch die gleichzeitige Messung vaskulärer Breiten mit Hellfeldmikroskopie (a Breite inclusive der "unsichtbaren" ESL) und Fluoreszenz-Mikroskopie eines vaskulären Tracer vom ESL ausgeschlossen, kann ESL Dicke wie die Hälfte der Differenz zwischen vaskulären Breiten 2 berechnet werden.
Die Verwendung von einem momentanen Maß für ESL Dicke für Studium des pulmonalen Glykocalix gut geeignet. Intravitalmikroskopie der Lunge ist eine Herausforderung, da signifikante pulmonale und kardiale Bewegungsartefakte. Während jüngsten Fortschritte zur Immobilisierung Mauslungen ermöglichen in vivo 12, 13, bestehen Bedenken hinsichtlich der physiologischen Auswirkungen von Lungen Stasis. Lung Immobilität wird mit einer verminderten endothelialen Stickstoffmonoxid Signalisierung 14, ein Signalweg, der sowohl Neutrophilen Adhäsion 15 und Lungenschädigung 16 Auswirkungen verbunden. Weiterhin Immobilisierung eines Bereichs von Lungen freilegt umgebenden mobilen Alveolen zu schädigenden Scherkräften (sogenannte "Atelektrauma"), in Übereinstimmung mit den Konzepten der klassischen physiologischenalveolären Interdependenz 17.
Im Jahre 2008 entwickelte Arata Tabuchi, Wolfgang Kübler und Kollegen eine chirurgische Technik die es erlaubt Intravitalmikroskopie einer frei beweglichen Mauslunge 18. Respiratorischen Artefakt aus diesem Verfahren kann durch die Verwendung von Hochgeschwindigkeits-Abbildungssystem, einschließlich gleichzeitige Messung von Hellfeld und Fluoreszenzmikroskopie negiert werden. In diesem Bericht ausführlich wir, wie momentane Dextran Ausschluss Bildgebung eingesetzt werden, um ESL Dicke im subpleural Mikrozirkulation einer frei beweglichen, in vivo Mauslunge messen. Diese Technik kann leicht modifiziert werden, um zu bestimmen Glykokalyx-Funktion Insbesondere die Fähigkeit eines intakten ESL auszuschließen zirkulierenden Elemente aus der endothelialen Oberfläche. Wir haben kürzlich diese Techniken verwendet werden, um die Bedeutung der pulmonalen ESL Integrität zur Entwicklung von akutem Lungenversagen während systemische entzündliche Erkrankungen wie Sepsis 2 zu bestimmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Koinzident mit dem expandierenden Verwendung von in vivo-Mikroskopie, gibt es zunehmende Wertschätzung sowohl für die beträchtliche Größe der ESL sowie dessen zahlreichen Beiträge Gefäßfunktion. Diese neuen Daten werden jedoch vor allem aus Studien der systemische Gefäßsystem abgeleitet. In der Tat, der in vivo-Mikroskopie in der Lunge zu verwenden ist technisch anspruchsvoll, da signifikante pulmonale und kardiale Bewegungsartefakte.
Mehrere neuere technische For…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Drs. Arata Tabuchi und Wolfgang Kübler (University of Toronto) für den Unterricht über Intravitalmikroskopie. Wir danken Andrew Cahill (Nikon Instruments) für die Unterstützung in der Mikroskopie Design und Implementierung. Diese Arbeit wurde vom NIH / NHLBI Zuschüsse P30 HL101295 und K08 HL105538 (auf EPS) finanziert.
Materials
| Name of Reagent | |||
| FITC-dextran (150 kDa) | Sigma | FD150S | |
| TRITC-dextran (150 kDa) | Sigma | T1287 | |
| Streptavidin-coated fluorescent microspheres | Bangs Laboratories | CP01F/10428 | Dragon Green fluorescence (similar to FITC) |
| Ketamine | Moore Medical | ||
| Xylazine | Moore Medical | ||
| Anti-ICAM-1 biotinylated antibody | eBioscience | Clone YN1/1.7.4 | 1:50 dilution |
| Isotype biotinylated antibody | eBioscience | IgG2b eB149/10H5 | 1:50 dilution |
| EQUIPMENT | |||
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | Inspira | |
| Tracheostomy catheter | Harvard Apparatus | 730028 | |
| Electrocautery apparatus | DRE Medical | Valleylab SSE-2L | |
| Bipolar cautery forceps | Olsen Medical | 10-1200I | 9.9cm McPherson |
| Temperature control system | World Precision Instruments | ATC1000 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump 11 Elite | |
| Microscope (widefield) | Nikon | LV-150 | |
| Microscope (confocal) | Nikon | A1R | |
| Image splitter | Photometrics | DV2 | |
| CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image processing software | Nikon | NIS Elements | |
| Polyvinylidene membrane | Kure Wrap | ||
| Circular cover slip | Bellco | 5CIR-1-BEL | 5 mm, #1 thickness |
| Glue (cover slip to membrane) | Pattex | Flussig (liquid) | For affixing cover slip to membrane |
| Glue (cover slip to mouse) | Pattex | Gel | For attaching membrane to mouse |
| Surgical tubing | Intramedic | PE50, PE10 | |
| Suture | Fisher | 4:0 silk | |
| Electric razor | Oster | 78997 | |
| Curved surgical forceps | Roboz | ||
| Straight surgical forceps | Roboz | ||
| Surgical scissors | Roboz | ||
| Surgical microscissors | Roboz | ||
| Surgical needle driver | Roboz | ||
| Surgical tape | Fisher | ||
| Kitchen sponges (cut into wedges) | various |
References
- Negrini, D., Tenstad, O., Passi, A., Wiig, H. Differential degradation of matrix proteoglycans and edema development in rabbit lung. AJP – Lung Cellular and Molecular Physiology. 290, L470-L477 (2006).
- Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nat. Med. 18, 1217-1223 (2012).
- Florian, J. A., et al. Heparan sulfate proteoglycan is a mechanosensor on endothelial cells. Circ. Res. 93, e136-e142 (2003).
- Chappell, D., et al. The Glycocalyx of the Human Umbilical Vein Endothelial Cell: An Impressive Structure Ex Vivo but Not in Culture. Circulation Research. 104, 1313-1317 (2009).
- Potter, D. R., Damiano, E. R. The hydrodynamically relevant endothelial cell glycocalyx observed in vivo is absent in vitro. Circ. Res. 102, 770-776 (2008).
- Weinbaum, S., Tarbell, J. M., Damiano, E. R. The Structure and Function of the Endothelial Glycocalyx Layer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 121-167 (2007).
- Pittet, M., Weissleder, R. Intravital Imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Kilpatrick, D. C., Graham, C., Urbaniak, S. J., Jeffree, C. E., Allen, A. K. A comparison of tomato (Lycopersicon esculentum) lectin with its deglycosylated derivative. Biochem. J. 220, 843-847 (1984).
- Smith, M. L., Long, D. S., Damiano, E. R., Ley, K. Near-wall micro-PIV reveals a hydrodynamically relevant endothelial surface layer in venules in vivo. Biophys. J. 85, 637-645 (2003).
- Vink, H., Duling, B. R. Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries. Circ. Res. 79, 581-589 (1996).
- Marechal, X., et al. Endothelial glycocalyx damage during endotoxemia coincides with microcirculatory dysfunction and vascular oxidative stress. Shock. 29, 572-576 (2008).
- Presson, R. G., et al. Two-Photon Imaging within the Murine Thorax without Respiratory and Cardiac Motion Artifact. The American Journal of Pathology. 179, 75-82 (2011).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Meth. 8, 91-96 (2011).
- Pearse, D. B., Wagner, E. M., Permutt, S. Effect of ventilation on vascular permeability and cyclic nucleotide concentrations in ischemic sheep lungs. J. Appl. Physiol. 86, 123-132 (1999).
- Hossain, M., Qadri, S., Liu, L. Inhibition of nitric oxide synthesis enhances leukocyte rolling and adhesion in human microvasculature. Journal of Inflammation. 9, 28 (2012).
- Schmidt, E. P., et al. Soluble guanylyl cyclase contributes to ventilator-induced lung injury in mice. AJP – Lung Cellular and Molecular Physiology. 295, L1056-L1065 (2008).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. J. Appl. Physiol. 28, 596-608 (1970).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J. Appl. Physiol. 104, 338-346 (2008).
- Gattinoni, L., Protti, A., Caironi, P., Carlesso, E. Ventilator-induced lung injury: the anatomical and physiological framework. Crit. Care Med. 38, 539-548 (2010).
- Tabuchi, A., Kim, M., Semple, J. W., Kuebler, W. M. Acute Lung Injury Causes Pendelluft Between Adjacent Alveoli In Vivo. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 183, A2490 (2011).
- Roebuck, K. A., Finnegan, A. Regulation of intercellular adhesion molecule-1 (CD54) gene expression. J. Leukoc. Biol. 66, 876-888 (1999).
