Mikrofluidischen Chip Herstellung und Verfahren zur Influenza Detect
Summary
Eine integrierte Mikrofluidvorrichtung thermoplastischen Chip zur Verwendung als molekulare Diagnostik entwickelt. Der Chip führt Nukleinsäureextraktion, reverse Transkriptase und PCR. Methoden zur Herstellung und den Betrieb der Chip beschrieben.
Abstract
Schnelle und effektive Diagnostik spielen eine wichtige Rolle bei der Steuerung Infektionskrankheit, die durch eine effektive Patienten-Management und Behandlung. Hier präsentieren wir einen integrierten mikrofluidischen thermoplastischen Chip mit der Fähigkeit zur Influenza-A-Virus bei Patienten Nasen-Rachen-(NP) Tupfer und saugt verstärken. Beim Laden der Patientenprobe, die Mikrofluideinheit sequentiell durchführt On-Chip Zelllyse, RNA-Reinigung und Konzentration in der Festphasenextraktion (SPE), die reverse Transkription (RT) und Polymerasekettenreaktion (PCR) in der RT-PCR-Kammern, jeweils. Endpunktbestimmung erfolgt mit einem außerhalb des Chips Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Für Peripheriegeräte, verwendeten wir ein einziges Spritzenpumpe, um Reagenz und Proben anzutreiben, während zwei Dünnschichtheizelemente als Wärmequellen für die RT und PCR Kammern wurden verwendet. Der Chip wurde entwickelt, um einzelne Schicht und geeignet für hohen Durchsatz, um die Fertigung zu reduzieren fabricatiZeit und Kosten. Der mikrofluidische Chip bietet eine Plattform für eine Vielzahl von Viren und Bakterien, die nur durch Änderungen im Reagenz-Design benötigt, um neue Krankheitserreger von Interesse erkennen beschränkt zu analysieren.
Introduction
Millionen von Todesfällen während der drei Influenza-Pandemien des 20. Jahrhunderts 1 berichtet. Darüber hinaus wurde die jüngste Influenza-Pandemie durch die Weltgesundheitsorganisation (WHO) zwei im Jahr 2009 erklärt, und zum 1. August 2010, 18.449 Todesfälle wurden von der WHO 3 angegeben. Diese Pandemie gezeigt erneut die hohe Belastung durch Infektionskrankheiten, und die Notwendigkeit für eine schnelle und präzise Erkennung von Influenza schnell Krankheiten Bestätigung entsprechende Reaktion des Gesundheitswesens und wirksame Behandlung 4 zu ermöglichen.
Es gibt mehrere Methoden häufig zur Diagnose von Influenza verwendet werden, umfassen diese schnelle Immunoassays, direkte Fluoreszenz-Antigen-Tests (DFA) und Viruskultur Methoden. Schnelle Immuntests drastisch fehlt Empfindlichkeit 5-8, während die beiden anderen Methoden arbeitsintensiv und zeitaufwendig 9 sind. Molekulare Tests bieten mehrere Vorteile, einschließlich einer kurzen Turn-around-Zeit, hohe Sensitduktivität und höhere Spezifität. Mehrere kommerzielle Einrichtungen haben zu schnellen molekularen Tests (auch als Nukleinsäure-Tests oder NATs) arbeitet für Infektionskrankheiten, und einige haben Influenza-Tests in ihren Pipelines. Doch die meisten von ihnen verlangen, Off-Chip-Probenvorbereitung. Keiner der Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA) verzichtet molekularen Tests beinhalten Probenvorbereitung in die Testkassette oder Modul.
Lab-on-a-Chip-Technik spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Point-of-Care-Prüfgeräte. Nach der Einführung des ersten PCR-Chip 1993 10 wurden zahlreiche Anstrengungen in die Entwicklung Nukleinsäure Testchips gesetzt worden. Haben jedoch nur wenige davon integrierten rohe Probenvorbereitung mit nachgeschalteter Verstärkung.
Wir haben zuvor die Miniaturisierung einer Festphasenextraktion Säule (SPE) in einem Kunststoff mikrofluidischen Chip 11 demonstriert und die Entment und Optimierung eines kontinuierlichen Stroms PCR-Chip 12. Hier erweitern wir die bisherigen Arbeiten, die SPE mit RT-und PCR-Schritte integriert in einem einzigen Chip für die klinische Diagnostik und demonstrieren ihre Fähigkeit, Nukleinsäuren aus Patienten Nasen-Rachen-(NP) Tupfer und saugt verstärken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die diagnostische hier vorgestellte Methode demonstriert die Fähigkeit eines integrierten mikrofluidischen Chip aus Kunststoff mit Influenza A RNA aus Patientenproben mit hoher Spezifität und eine niedrige Nachweisgrenze zu verstärken 13 Wir haben diesen Chip für potenzielle point of care testing:. (A) die Temperatur und Fluidik Steuerung vereinfacht wurden, (b) der Chip ist kostengünstig und eignet sich für einen hohen Durchsatz Herstellung im Spritzgussverfahren, und (c) der Chip ist ein Einwegartikel…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NIH) grant R01 EB008268 unterstützt.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number |
| 1-dodecanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 443816-500G |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 196118-50G |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2943CA |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 19516 |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 239852-50G |
| BSA | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | A7979-50ML |
| Butyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 235865-100 ml |
| Carrier RNA | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 |
| Cyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 105899-1L |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 |
| Ethylene dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335861 |
| Ethylene glycol dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335681-100ML |
| Glass syringe 250 μl | Hamilton, Reno, NV | 81127 |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 50981 |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 5067-4626 |
| Hot press | Carver,Wabash, IN | 4386 |
| J-B Weld Epoxies | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 7605A11 |
| Luer-Lok syringes | BD-Medical, Franklin Lakes, NJ | 309628 |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | AB-0359 |
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 494437 |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M55909 |
| Nanoport | Upchurch Scientific | N-333-01 |
| Nanoport Fitting | Upchurch Scientific | F-120x |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | PR-P1193 |
| OneStep RT-PCR kit | Qiagen, Valencia, CA | 210210 |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 41009 |
| Power supply | VWR,Radnor, PA | 300V |
| RNAse Away | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 83931-250ML |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 |
| Silica microspheres | Polysciences,Warrington, PA | 24324-15 |
| Syringe pump | Harvard Apparatus,Holliston, MA | HA2000P/10 |
| Thermally Conductive Tape | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 6838A11 |
| Thermocouple | Omega Engineering, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 |
| Thin-film Heaters | Minco,Minneapolis, MN | HK5166R529L12A |
| Ultraviolet Crosslinker | UPV, Upland, CA | CL-1000 |
| Zeonex | Zeon Chemicals, Louisville, KY | 690R |
References
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