Une puce microfluidique intégré thermoplastique a été mis au point pour une utilisation comme diagnostic moléculaire. La puce effectue l'extraction d'acide nucléique, la transcriptase inverse et la PCR. Des procédés de fabrication et le fonctionnement de la puce sont décrits.
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Article de méthode
Fabrication puce microfluidique et méthode pour la détection de la grippe
Dans cet article
Résumé
Résumé
Diagnostics rapides et efficaces jouent un rôle important dans le contrôle des maladies infectieuses en permettant une gestion efficace des patients et le traitement. Ici, nous présentons une puce microfluidique intégré thermoplastique avec la capacité d'amplifier le virus grippal A dans les patients nasopharyngé (NP) des tampons et des ponctions. Lors du chargement de l'échantillon du patient, le dispositif microfluidique porte successivement sur la lyse des cellules sur puce, la purification de l'ARN et des étapes de concentration au sein de l'extraction en phase solide (SPE), la transcription inverse (RT) et la réaction en chaîne par polymérase (PCR) en RT-PCR chambres, respectivement. Point final de détection est réalisée à l'aide d'un Bioanalyzer hors puce (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Pour les périphériques, nous avons utilisé une pompe à seringue unique à conduire des réactifs et des échantillons, tandis que deux appareils de chauffage à couches minces ont été utilisés comme source de chaleur pour la RT et la PCR chambres. La puce est conçue pour être simple couche et adaptée pour la fabrication à haut débit pour réduire la fabricatile temps et le coût. La puce microfluidique offre une plateforme pour analyser une grande variété de virus et de bactéries, limitée seulement par des changements dans la conception des réactifs nécessaires à la détection de nouveaux agents pathogènes d'intérêt.
Introduction
Des millions de décès ont été rapportés au cours des trois pandémies de grippe du 20e siècle 1. En outre, la pandémie de grippe la plus récente a été déclarée par l'Organisation mondiale de la Santé (OMS) 2 en 2009, et à partir de Août 1, 2010, 18 449 décès ont été signalés par l'OMS 3. Cette pandémie a démontré encore une fois la forte charge de maladies infectieuses, et la nécessité d'une détection rapide et précise de la grippe pour permettre la confirmation des maladies rapide, appropriée réponse de santé publique et un traitement efficace 4.
Il existe plusieurs méthodes couramme....
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Protocole
1. 12 Fabrication puce
- Faites deux plaques de pastilles 690R Zeonex: distribuer des pastilles de 8-9 grammes Zeonex uniformément dans le centre d'une plaque de métal, préchauffer à la presse chauffée à 198 ° C pendant 5 min, puis appliquer une pression lentement à 2.500 psi pour encore 5 min. Pour compléter cette étape, nous avons utilisé une presse Carver chaude.
- Gaufrer le canal microfluidique dans la plaque de moule avec une résine époxy. Détails sur le moule de fabrication sont décrites ailleurs 12 (canal de la conception à la figure 2b): mettez une plaque sur le moule époxy; préchauffer sur la press....
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Résultats
Un résultat typique est illustré à la figure 3 pour une grippe A spécimen infecté lavage nasopharyngé. En raison des quantités différentes de virus de la grippe dans chaque échantillon de patient, la concentration finale du produit de PCR est variable. Un bon résultat devrait avoir un faible bruit, deux pics échelle claires (35 et 10380 pb) et un pic seul produit à la taille du produit conçu (107 pb) pour l'échantillon positif. Alors que le pic du produit devrait théoriquement être absent pour.......
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Discussion
La méthode de diagnostic présenté ici a démontré la capacité d'une puce microfluidique intégré en plastique pour amplifier l'ARN de la grippe A partir d'échantillons de patients avec une haute spécificité et une limite de détection plus bas depuis 13 Nous avons conçu cette puce pour le point de potentiel des tests précaution:. (A) la température et fluidique de contrôle ont été simplifiées, (b) la puce est peu coûteux et convenant à la fabrication à haut débit utilisant le moulage par injection, e.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts financiers.
Remerciements
Cette recherche a été financée par les Instituts nationaux de la santé (NIH) subvention R01 EB008268.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom de réactif / Matériel | Entreprise | Numéro de catalogue | |
| 1-dodécanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 443816-500G | |
| 2,2-diméthoxy-2-phénylacétophénone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 196118-50G | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2943CA | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 19516 | |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 239852-50G | |
| BSA | Thermo Fisher Scientific, pittsburge, PA | A7979-50ML | |
| Le méthacrylate de butyle | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 235865-100 ml | |
| ARN entraîneur | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 | |
| Cyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 105899-1L | |
| L'éthanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | |
| Le diméthacrylate d'éthylène | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335861 | |
| Diméthacrylate d'éthylène glycol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335681-100ML | |
| Seringue en verre 250 pi | Hamilton, Reno, NV | 81127 | |
| Le thiocyanate de guanidine | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 50981 | |
| Haute Sensibilité Kit ADN | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 5067-4626 | |
| Presse à chaud | Carver, Wabash, IN | 4386 | |
| JB Weld Epoxies | Mcmaster-Carr, Elmhurst, IL | 7605A11 | |
| Luer-Lok seringues | BD-médicale, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Chlorure de magnésium | Thermo Fisher Scientific, pittsburge, PA | AB-0359 | |
| Méthanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 494437 | |
| Le méthacrylate de méthyle | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M55909 | |
| Nanoport | Upchurch Scientific | N-333-01 | |
| Montage Nanoport | Upchurch Scientific | F-120x | |
| Nucléase sans eau | Thermo Fisher Scientific, pittsburge, PA | PR-p1193 | |
| OneStep RT-PCR kit | Qiagen, Valencia, CA | 210210 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 41009 | |
| Alimentation | VWR, Radnor, PA | 300V | |
| RNase Away | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 83931-250ML | |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 | |
| Microsphères de silice | Polysciences, Warrington, PA | 24324-15 | |
| Pompe à seringue | Harvard Apparatus, Holliston, MA | HA2000P/10 | |
| Bande thermiquement conductrice | McMaster-Carr, Elmhurst, IL | 6838A11 | |
| Thermocouple | Omega Engineering, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 | |
| Couche mince chauffe | Minco, Minneapolis, MN | HK5166R529L12A | |
| Crosslinker ultraviolet | UPV, Upland, CA | CL-1000 | |
| Zeonex | Zeon Chemicals, Louisville, KY | 690R |
Références
- Nicholls, H. Pandemic Influenza: The Inside Story. PLoS Biol. 4, (2006).
- WHO | World now at the start of 2009 influenza pandemic. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/h1n1_pandemic_phase6_20090611/en/ (2009).
- WHO | Pandemic (H1N1) 2009 - update 112. , World Health Organ....
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