Микрофлюидных Изготовление Чип и метод для выявления гриппа
Summary
Интегрированный чип микрофлюидных термопластичных была разработана для использования в качестве молекулярной диагностики. Чип выполняет выделения нуклеиновых кислот, обратной транскриптазы, и ПЦР. Методы изготовления и запуска чипа описаны.
Abstract
Быстрая и эффективная диагностика играет важную роль в борьбе с инфекционными заболеваниями, позволяя пациенту эффективное управление и лечения. Здесь мы представляем интегрированное микрофлюидных термопластичных чип с возможностью усиливать вируса гриппа А в больной носоглотки (NP) тампоны и аспирации. При загрузке образца пациента, микрофлюидных устройство последовательно выполняет на кристалле лизиса клеток, РНК очистки и концентрирования шаги в твердофазной экстракции (SPE), обратной транскрипции (RT) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) в RT-PCR камер, соответственно. Конечные точки обнаружение осуществляется с помощью внешней памяти Bioanalyzer (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния). Для периферийных устройств, мы использовали один насос шприца ездить реагентов и образцов, в то время как два тонких нагреватели фильма были использованы в качестве источников тепла для РТ и ПЦР-камер. Чип предназначен для однослойных и подходит для высоких производственных пропускной способности для уменьшения fabricatiпо времени и стоимости. Микрофлюидный чип обеспечивает платформу для анализа широкого спектра вирусов и бактерий, ограничивается только изменениями в дизайне реагента, необходимого для обнаружения новых патогенов интерес.
Introduction
Миллионы смертей были зарегистрированы в течение трех пандемий гриппа 20-го века 1. Кроме того, самые последние пандемии гриппа была объявлена Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) 2 в 2009 году, и по состоянию на 1 августа 2010 года, 18 449 смертей были зарегистрированы ВОЗ 3. Эта пандемия вновь продемонстрировали высокое бремя инфекционных заболеваний, а также необходимость быстрого и точного обнаружения гриппа для быстрого подтверждения заболевания, соответствующего реагирования общественного здравоохранения и эффективное лечение 4.
Есть несколько методов, широко используется для диагностики гриппа, к ним относятся быстрое иммунологических, прямые флуоресцентные тест на антиген (DFA) и вирусные методы культуры. Быстрое иммунологических резко не хватает чувствительности 5-8, в то время как два других метода являются трудоемкими и отнимает много времени 9. Молекулярные тесты предлагают несколько преимуществ, включая короткое время оборота, высокой СЕНСИТivity, и более высокую специфичность. Несколько коммерческих структур работают над быстрых молекулярных тестов (также называемые нуклеиновые кислоты или тестов NAT) для инфекционных заболеваний, а некоторые из них имеют гриппа анализы в своих трубопроводах. Однако большинство из них требуют вне чипа подготовки образца. Ни один из клинической лаборатории Улучшение Поправки (CLIA) отказался молекулярные тесты включают образцы препарата в картридже анализа или модуля.
Лаборатория-на-чипе технология играет важную роль в развитии точка-санитарной помощи устройства тестирования. После введения первого чипа ПЦР в 1993 10, многочисленные усилия были вложены в разработку чипов нуклеиновых кислот тест. Тем не менее, лишь немногие из них имеют интегрированный сырой подготовки образца с выходным усилением.
Ранее мы показали миниатюризации твердых колонке экстракции (SPE) в пластиковый микрофлюидных чипов 11 и развиватьсяния и оптимизации непрерывного потока ПЦР чип 12. Здесь мы расширим предыдущую работу по интеграции SPE с RT и ПЦР шагов в одном чипе для клинической диагностики и продемонстрировать свою способность усиливать нуклеиновых кислот от пациента носоглотки (NP) тампоны и аспирации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод диагностики, представленные здесь продемонстрировали способность интегрированной микрофлюидных пластиковых чипов для усиления гриппа РНК из образцов пациентов с высокой специфичностью и низкий предел обнаружения 13 Мы разработали этот чип для потенциальной точкой уход?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Национальным институтом здоровья (NIH), грант R01 EB008268.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number |
| 1-dodecanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 443816-500G |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 196118-50G |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2943CA |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 19516 |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 239852-50G |
| BSA | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | A7979-50ML |
| Butyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 235865-100 ml |
| Carrier RNA | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 |
| Cyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 105899-1L |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 |
| Ethylene dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335861 |
| Ethylene glycol dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335681-100ML |
| Glass syringe 250 μl | Hamilton, Reno, NV | 81127 |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 50981 |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 5067-4626 |
| Hot press | Carver,Wabash, IN | 4386 |
| J-B Weld Epoxies | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 7605A11 |
| Luer-Lok syringes | BD-Medical, Franklin Lakes, NJ | 309628 |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | AB-0359 |
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 494437 |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M55909 |
| Nanoport | Upchurch Scientific | N-333-01 |
| Nanoport Fitting | Upchurch Scientific | F-120x |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | PR-P1193 |
| OneStep RT-PCR kit | Qiagen, Valencia, CA | 210210 |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 41009 |
| Power supply | VWR,Radnor, PA | 300V |
| RNAse Away | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 83931-250ML |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 |
| Silica microspheres | Polysciences,Warrington, PA | 24324-15 |
| Syringe pump | Harvard Apparatus,Holliston, MA | HA2000P/10 |
| Thermally Conductive Tape | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 6838A11 |
| Thermocouple | Omega Engineering, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 |
| Thin-film Heaters | Minco,Minneapolis, MN | HK5166R529L12A |
| Ultraviolet Crosslinker | UPV, Upland, CA | CL-1000 |
| Zeonex | Zeon Chemicals, Louisville, KY | 690R |
References
- Nicholls, H. Pandemic Influenza: The Inside Story. PLoS Biol. 4, (2006).
- Wenzel, J. J., et al. Analytical performance determination and clinical validation of the novel roche realtime ready influenza A/H1N1 detection set. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3088-3094 (2010).
- Chan, K. H., et al. Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1. Journal of Clinical Virology: the. 45, 205-207 (2009).
- Ginocchio, C. C., et al. Evaluation of multiple test methods for the detection of the novel 2009 influenza A (H1N1) during the New York City outbreak. Journal of. 45, 191-195 (2009).
- Aeron, C. H., et al. Performance of influenza rapid point-of-care tests in the detection of swine lineage A(H1N1) influenza viruses. Influenza and Other Respiratory Viruses. 3, 171-176 (2009).
- Takahashi, H., Otsuka, Y., Patterson, B. Diagnostic tests for influenza and other respiratory viruses: determining performance specifications based on clinical setting. Journal of Infection and Chemotherapy. 16, 155-161 (2010).
- Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of Three Influenza A and B Real-Time Reverse Transcription-PCR Assays and a New 2009 H1N1 Assay for Detection of Influenza Viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3870-3875 (2009).
- Northrup, M. A., Ching, M. T., White, R. M., Watson, R. T. . Transducer’93, seventh international conference on solid state sensors and actuators. , 924-926 (1993).
- Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. Thermoplastic microfluidic device for on-chip purification of nucleic acids for disposable diagnostics. Analytical Chemistry. 78, 788-792 (2006).
- Cao, Q., Kim, M. -. C., Klapperich, C. Plastic microfluidic chip for continuous-flow polymerase chain reaction: Simulations and experiments. Biotechnology Journal. 6, 177-184 (1002).
- Cao, Q., et al. Microfluidic Chip for Molecular Amplification of Influenza A RNA in Human Respiratory Specimens. PLoS ONE. 7, e33176 (2012).
- Rådström, P. Purification and Characterization of PCR-Inhibitory Components in Blood Cells. J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).
- Boddinghaus, B., Wichelhaus, T. A., Brade, V., Bittner, T. Removal of PCR Inhibitors by Silica Membranes: Evaluating the Amplicor Mycobacterium tuberculosis Kit. J. Clin. Microbiol. 39, 3750-3752 (2001).
- Andreasen, D., et al. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50, S6-S9 (2010).
