Mikroakışkan Chip İmalat ve İnfluenza Algılama Yöntemi
Summary
Entegre mikroakışkan termoplastik çip bir moleküler tanı olarak kullanılmak üzere geliştirilmiştir. Çip nükleik asit ekstraksiyon, ters transkriptaz ve PCR gerçekleştirir. Imalatı ve yonga çalıştırmak için yöntemler tarif edilmiştir.
Abstract
Hızlı ve etkili bir teşhis etkili hasta yönetimi ve tedavi sağlayarak bulaşıcı hastalık kontrolünde önemli bir rol oynar. Burada, hastanın nazofarengeal (NP) bezlerden ve aspirat olarak influenza A virusu yükseltmek için yeteneği ile entegre bir mikroakışkan termoplastik çip sunuyoruz. Hasta örneği yükleme üzerine, mikroakışkan cihaz sırayla, on-chip hücre parçalama, RNA saflaştırılması ve katı faz ekstraksiyonu (SPE), ters transkripsiyon (RT) ve RT-PCR odalarına polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) içindeki konsantrasyonu adımları yürütmektedir sırasıyla. Bitiş noktası algılama bir off-çip Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) kullanılarak yapılır. İki ince film ısıtıcılar RT ve PCR odaları için ısı kaynağı olarak kullanılabilir iken çevre için, biz, reaktif ve numune sürücü tek bir şırınga pompası kullanılır. Yonga fabricati azaltmak için yüksek kapasiteli imalatı için tek tabaka ile uygun olacak şekilde tasarlanmıştırzaman ve maliyet. Mikroakışkan çip ilgi yeni patojenlerin saptanması için gerekli reaktif tasarım değişiklikleri ile sınırlıdır virüs ve bakterilerin geniş bir yelpazede, analiz için bir platform sağlar.
Introduction
Ölümlerin Milyonlarca 20. yüzyılın 1. üç influenza pandemisi sırasında bildirilmiştir. Ayrıca, en son grip salgını 2009 yılında Dünya Sağlık Örgütü (WHO) 2 tarafından ilan edildi, ve 1 Ağustos 2010 arasında, 18.449 ölüm DSÖ 3 tarafından rapor edilmiştir. Bu salgın yine bulaşıcı hastalıkların yüksek yük ve hızlı hastalığın teyidi, uygun halk sağlığı yanıtı ve etkili tedavi 4 etkinleştirmek için grip hızlı ve doğru algılanması için ihtiyaç göstermiştir.
Yaygın influenza teşhisi için kullanılan birkaç yöntem vardır, bu hızlı immunoassay, direkt floresan antijen testi (DFA) ve viral kültür yöntemleri içerir. Diğer iki yöntem emek-yoğun ve 9 zaman alıcı iken Hızlı immunoassay dramatik, hassasiyet 5-8 yoksundur. Moleküler testler kısa bir geri dönüş süresine, yüksek sensit dahil birçok avantajlar sunarivity ve spesifitesi yüksek. Çeşitli ticari kuruluşlar bulaşıcı hastalıklar için hızlı moleküler testler (ayrıca nükleik asit testleri veya NAT olarak adlandırılır) doğru çalışıyor olması ve birkaç kendi hatlarında grip deneyleri var. Ancak çoğu çip dışı numune hazırlama gerektirir. Moleküler testler test kartuşu veya modülün içine numune hazırlama dahil feragat Klinik Laboratuar Geliştirme Değişiklikleri (CLIA) Yok.
Lab-on-a-çip teknolojisi noktası bakım test cihazları gelişiminde önemli bir rol oynar. 1993 10 yılında ilk PCR çip girişten sonra, çeşitli girişimlere nükleik asit testi cips gelişmekte girmiştir. Ancak, bunlardan sadece birkaç aşağı amplifikasyon ile entegre ham numune hazırlama var.
Biz daha önce bir plastik mikroakışkan çip 11 içine bir katı faz ekstraksiyonu sütun (SPE) ve minyatür gösterdi ve geliştirmek varsürekli bir akış PCR çip 12 Ment ve optimizasyonu. Burada, klinik teşhis için tek bir yonga içine RT ve PCR adımlarla SPE entegre ve hasta nazofaringeal (NP) bezlerden ve aspirat nükleik asitlerin yükseltmek için kapasitesini göstermek için önceki çalışmaları genişletmek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tanı yöntemi yüksek özgüllük ve düşük algılama sınırı ile hasta örneklerinde, influenza A RNA yükseltmek için entegre bir mikroakışkan plastik çipin yeteneği göstermiştir Burada sunulan 13 Biz bakım test potansiyeli noktası için bu çip tasarlanmıştır:. (A) sıcaklık ve akışkan kontrol basitleştirilmiştir, (b) yonga düşük maliyet ve enjeksiyon kalıplama kullanılarak yüksek akış üretim için uygun olan ve (c) yonga ve böylece numune çapraz kirlenmenin azaltılması e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) hibe R01 EB008268 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number |
| 1-dodecanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 443816-500G |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 196118-50G |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2943CA |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 19516 |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 239852-50G |
| BSA | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | A7979-50ML |
| Butyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 235865-100 ml |
| Carrier RNA | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 |
| Cyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 105899-1L |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 |
| Ethylene dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335861 |
| Ethylene glycol dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335681-100ML |
| Glass syringe 250 μl | Hamilton, Reno, NV | 81127 |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 50981 |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 5067-4626 |
| Hot press | Carver,Wabash, IN | 4386 |
| J-B Weld Epoxies | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 7605A11 |
| Luer-Lok syringes | BD-Medical, Franklin Lakes, NJ | 309628 |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | AB-0359 |
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 494437 |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M55909 |
| Nanoport | Upchurch Scientific | N-333-01 |
| Nanoport Fitting | Upchurch Scientific | F-120x |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | PR-P1193 |
| OneStep RT-PCR kit | Qiagen, Valencia, CA | 210210 |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 41009 |
| Power supply | VWR,Radnor, PA | 300V |
| RNAse Away | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 83931-250ML |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 |
| Silica microspheres | Polysciences,Warrington, PA | 24324-15 |
| Syringe pump | Harvard Apparatus,Holliston, MA | HA2000P/10 |
| Thermally Conductive Tape | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 6838A11 |
| Thermocouple | Omega Engineering, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 |
| Thin-film Heaters | Minco,Minneapolis, MN | HK5166R529L12A |
| Ultraviolet Crosslinker | UPV, Upland, CA | CL-1000 |
| Zeonex | Zeon Chemicals, Louisville, KY | 690R |
References
- Nicholls, H. Pandemic Influenza: The Inside Story. PLoS Biol. 4, (2006).
- Wenzel, J. J., et al. Analytical performance determination and clinical validation of the novel roche realtime ready influenza A/H1N1 detection set. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3088-3094 (2010).
- Chan, K. H., et al. Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1. Journal of Clinical Virology: the. 45, 205-207 (2009).
- Ginocchio, C. C., et al. Evaluation of multiple test methods for the detection of the novel 2009 influenza A (H1N1) during the New York City outbreak. Journal of. 45, 191-195 (2009).
- Aeron, C. H., et al. Performance of influenza rapid point-of-care tests in the detection of swine lineage A(H1N1) influenza viruses. Influenza and Other Respiratory Viruses. 3, 171-176 (2009).
- Takahashi, H., Otsuka, Y., Patterson, B. Diagnostic tests for influenza and other respiratory viruses: determining performance specifications based on clinical setting. Journal of Infection and Chemotherapy. 16, 155-161 (2010).
- Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of Three Influenza A and B Real-Time Reverse Transcription-PCR Assays and a New 2009 H1N1 Assay for Detection of Influenza Viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3870-3875 (2009).
- Northrup, M. A., Ching, M. T., White, R. M., Watson, R. T. . Transducer’93, seventh international conference on solid state sensors and actuators. , 924-926 (1993).
- Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. Thermoplastic microfluidic device for on-chip purification of nucleic acids for disposable diagnostics. Analytical Chemistry. 78, 788-792 (2006).
- Cao, Q., Kim, M. -. C., Klapperich, C. Plastic microfluidic chip for continuous-flow polymerase chain reaction: Simulations and experiments. Biotechnology Journal. 6, 177-184 (1002).
- Cao, Q., et al. Microfluidic Chip for Molecular Amplification of Influenza A RNA in Human Respiratory Specimens. PLoS ONE. 7, e33176 (2012).
- Rådström, P. Purification and Characterization of PCR-Inhibitory Components in Blood Cells. J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).
- Boddinghaus, B., Wichelhaus, T. A., Brade, V., Bittner, T. Removal of PCR Inhibitors by Silica Membranes: Evaluating the Amplicor Mycobacterium tuberculosis Kit. J. Clin. Microbiol. 39, 3750-3752 (2001).
- Andreasen, D., et al. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50, S6-S9 (2010).
