היווצרות של האפיתל ערמונית אנושי באמצעות רקומבינציה של רקמות ואברי מין מכרסם mesenchyme סינוס ותאי גזע אנושיים
Summary
כדי לפענח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס המוקדם סרטן ערמונית ייזום, רומן ומערכות מודל אדם חדשניים וגישות הם זקוקים נואשים. הפוטנציאל של טרום ערמונית ואברי המין סינוס mesenchyme (UGSM) כדי לגרום לאוכלוסיות תאי גזע pluripotent כדי ליצור אפיתל ערמונית אנושי הוא כלי רב עוצמה במחקר ניסיוני ערמונית.
Abstract
התקדמות במחקר סרטן הערמונית היא מוגבלת מאוד על ידי הזמינות של מערכות מודל אדם נגזרות והורמונים נאיביים, המגבילות את היכולת שלנו להבין את האירועים גנטיים ומולקולריים העומדים בבסיס מחלה ייזום ערמונית. לקראת פיתוח מערכות מודל טוב יותר ללימוד ערמונית אנושית סרטן, אנחנו ואחרים ניצלו את פוטנציאל אינדוקטיבי פרו ערמונית הייחודי של המכרסם העוברי ערמונית stroma, כינה ואברי המין סינוס mesenchyme (UGSM). כאשר recombined עם אוכלוסיות תאי pluripotent מסוימות, כגון תאי גזע עובריים, UGSM גורם להיווצרותו של אדם נורמלי ערמונית epithelia באופן תלוי בטסטוסטרון. מערכת כזו מודל אנושית יכולה לשמש כדי לחקור באופן ניסיוני ולבחון את היכולת של גני רגישות לסרטן ערמונית מועמד בקצב מואץ בהשוואה למחקרים מהונדסים מכרסמים טיפוסיים. מאחר ותאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) יכולים להיות מהונדסים גנטי בתרבות usinביטוי גנים מושרה G או siRNA עקום למטה וקטורים שקדמו לרקומבינציה רקמות, מודל כזה מאפשר בדיקת ההשלכות התפקודיות של גנים, או שילובים של גנים, אשר נחשבים כדי לקדם או למנוע היווצרות סרטן.
הטכניקה של בידוד אוכלוסיות טהורות של תאי UGSM, לעומת זאת, הוא מאתגר ולמידה לעתים קרובות דורשת מישהו עם מומחיות קודמת ללמד באופן אישי. יתר על כן, חיסון של תערובות תאים תחת הקפסולה הכליות של מארח immunocompromised יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית. כאן אנו מתארים וממחישים בידוד נכון של UGSM מעוברי מכרסמים והשתלת הכליה כמוסה של תערובות רקמות כדי ליצור אפיתל ערמונית אנושי. גישה כזו, בשלב הנוכחי שלה, דורשת in vivo xenografting של תאי גזע עובריים, שעלולים להיות יישומים עתידיים יכולים לכלול בהיווצרות בלוטת מבחנה או את השימוש של אוכלוסיות תאי גזע pluripotent מושרה (iPSCs).
Introduction
יש צורך עצום במערכות מודל אנושיות טובות יותר של סרטן הערמונית. בפרט, מערכות מודל אדם רלוונטיות של רקמות ערמונית נורמליות, שאינם ממאירות אשר ניתן מניפולציות גנטית כדי להבחין את התפקיד של גנים ספציפיים באופן ישיר בייזום של סרטן הערמונית היינו להיות אינפורמטיבי מאוד. כניסתו של העידן הגנומי זיהתה מספר רב של גנים שעשויים להיות תפקיד בהיווצרות הסרטן. חוסר מערכות מודל ניסיוני אדם, לעומת זאת, קשה פוגע ביכולת שלנו כדי לבחון בחינה התפקודית ולאפיין גני רגישות לסרטן ערמונית מועמד. מערכת מודל אידיאלית תהיה להקל על הניתוח הפונקציונלי המהיר ומהיר יותר של גני רגישות לסרטן בשילוב עם מערכות מודל מכרסמים מהונדסים מתאימות. יתר על כן, מערכת מודל אנושית כזה תאפשר אפיון מולקולרי של מנגנוני האיתות של ערמונית היווצרות הסרטן לעבר הגילוי והאימות של טיפולים חדשניים ללמנוע היווצרות סרטן הערמונית.
תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) מסוגלים להרכיב רקמות ערמונית אדם כxenografts. בשנת 2006 טיילור, et al. דיווח כי יכול להיגרם hESCs כדי ליצור epithelia ערמונית in vivo כשמחדש בשילוב עם מכרסמים ואברי המין סינוס mesenchyme (UGSM) בתוך פרק זמן של 8-12 שבועות. 1 מחקרים אלה התבססו על עבודה קודמת של המעבדה Cunha מראה כי UGSM עוברי המכרסמים יכולה לקדם את הבידול של הערמונית של תאי גזע ואוכלוסיות תאי אפיתל עובריים in vivo. 2,3 הערמונית מתפתחת מanlagen עוברי נקרא סינוס ואברי המין (UGS), ולפני 17 יום העוברי (עכבר E17 ; יום E18 בחולדה) ניתן להסיר את UGS ומחולק פיזי לתוך האפיתל (UGSE) וmesenchyme (UGSM) 4 גישת רקומבינציה רקמה זו שיפרה את ההבנה של התפתחות סרטן הערמונית ו, בפרט שלנו באופן משמעותי.גורם ly צמיחה ומסלולי איתות הורמונליים ואת מערכות יחסים בין מולקולריים ערמונית סטרומה והאפיתל. 5-8 שיטה זו כרוכה בשילוב vivo לשעבר של UGSM עם גזע או תאי האפיתל מאותם מינים או מובחנים וrecombinants הסלולרי / רקמה אלה מושתלים וגדל וxenografts בתוך מארח עכבר. 4,9 לאחר תקופה של צמיחה בvivo, השתל מכיל מבני בלוטות אפיתל ערמונית משובצים ברקמת סטרומה. ניתן לבצע צביעה נוספת כדי לקבוע אם מבנים כאלה הם באמת של הערמונית והוא המעשה ידי האדם. 10,11
Protocol
Representative Results
Discussion
רקומבינציה רקמות באמצעות UGSM היא טכניקה שימושית להפליא כדי לחקור את התפתחותו של סרטן הערמונית ואת האירועים המולקולריים מובילים לייזום סרטן הערמונית. הפוטנציאל אינדוקטיבית של UGSM שימש במשך מספר רב של יישומים בערמונית מחקר, אלה כוללים גידול שיפור לקחת משורות תאי ערמונ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו רוצים לציין את התמיכה של האוניברסיטה שיקגו סעיף לאורולוגיה בראשותו של ד"ר אריה להב, ומנהל מחקר אורולוגית ד"ר קארי רינקר-שפר. אנחנו גם רוצים להכיר את התמיכה מאוניברסיטת המרכז לסרטן של שיקגו (UCCCC) בראשות של ד"ר מישל Le Beau. אנחנו גם עם להודות לסיוע טכני מומחה של מתקן הרקמה האנושי מרכז משאבי ליבה בראשות ד"ר מארק Lingen, וסיוע של לזלי מרטין ומרי ג'ו פקטה. אנו מודים גם מתקן Core אימונוהיסטוכימיה מנוהל על ידי טרי לי. עבודה זו מומנה על ידי אוניברסיטת שיקגו מחלקה לכירורגיה, אורולוגיה של סעיף; האגודה אמריקנית לסרטן מוסדי מענק מחקר (ACS-IRG, # IRG-58-004); מרכז סרטן התמיכה גרנט (P30 CA14599); Brinson קרן; קרן אלווין באום המשפחה; אוניברסיטת שיקגו דירקטוריון קרן לחקר סרטן של הנשים; ס Kregel נתמך על ידי HHMI: עמיתי מד ל- גראדירך (56006772) וסרטן הביולוגיה הדרכה גרנט (T32-CA09594). לבסוף, ברצוננו להודות לרוברט קלארק, ד"ר VenkateshKrishnan, ונתן Stadick להערכה הביקורתית של כתב היד שלהם.
Materials
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO | 14170 | |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11330 | |
| R1881 | Sigma | 965-93-5 | Mix to 1 ug/ml in Ethanol (1,000x stock) |
| NEAA | GIBCO | 11140 | |
| Pen-Strep Solution | GIBCO | 15070 | 100x stock |
| Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| KETASET (ketamine hydrochloride) | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-2013-01 | 100 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline |
| AnaSed (xylazine) | VET-A-MIX, Inc. | NADA 139-236 | 20 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline |
| Trypsin | BD Biosciences | 215240 | |
| Collagenase | Sigma | C2014 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge | NDC 0856-4396-01 | 100 mg/ml; dilute 1:1,000 in sterile saline |
| Altalube eye ointment | Altaire Pharmaceuticals, Inc. | NLC 56641-19850 | |
| Leica MZ16 F Stereomicroscope | Leica | Any good dissecting scope can be used. | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Syringe | Hamilton | 84855 | |
| Hamilton Needle, Small RN, 28 gauge, 0.5inches, Point Style #3 (Blunt) | Hamilton | 7803-02 | Custom Needle |
| Ethanol Prep Pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | |
| Sterile Gauze Pads | Fisher Scientific | 22-415-469 | |
| Ethicon Vicryl Suture (4-0 FS-2) | MedVet International | J392H | Needle-in, dissolvable suture |
| Autoclip 9 mm Wound Clips | Becton Dickenson | 427631 | |
| PVP Iodine Prep Pads | Fisher Scientific | 06-669-98 | |
| Dissector scissor with blunt end | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Dumont fine tip forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Needle holder with Scissor | Fine Science Tools | 12002-14 |
References
- Taylor, R. A., et al. Formation of human prostate tissue from embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 179-181 (2006).
- Cunha, G. R., Chung, L. W. Stromal-epithelial interactions–I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice. J. Steroid Biochem. 14, 1317-1324 (1981).
- Cunha, G. R., Chung, L. W., Shannon, J. M., Taguchi, O., Fujii, H. Hormone-induced morphogenesis and growth: role of mesenchymal-epithelial interactions. Recent Prog. Horm. Res. 39, 559-598 (1983).
- Staack, A., Donjacour, A. A., Brody, J., Cunha, G. R., Carroll, P. Mouse urogenital development: a practical approach. Differentiation. 71, 402-413 (2003).
- Cunha, G. R., et al. Normal and abnormal development of the male urogenital tract. Role of androgens, mesenchymal-epithelial interactions, and growth factors. J. Androl. 13, 465-475 (1992).
- Cunha, G. R., et al. Growth factors as mediators of androgen action during the development of the male urogenital tract. World J. Urol. 13, 264-276 (1995).
- Aboseif, S., El-Sakka, A., Young, P., Cunha, G. Mesenchymal reprogramming of adult human epithelial differentiation. Differentiation. 65, 113-118 (1999).
- Marker, P. C., Donjacour, A. A., Dahiya, R., Cunha, G. R. Hormonal, cellular, and molecular control of prostatic development. Dev. Biol. 253, 165-174 (2003).
- Cunha, G. R., Sekkingstad, M., Meloy, B. A. Heterospecific induction of prostatic development in tissue recombinants prepared with mouse, rat, rabbit and human tissues. Differentiation. 24, 174-180 (1983).
- Van der Griend, D. J., et al. The Role of CD133 in Normal Human Prostate Stem Cells and Malignant Cancer Initiating Cells. Cancer Res. 68, 9703-9711 (2008).
- Van der Griend, D. J., Konishi, Y., De Marzo, A. M., Isaacs, J. T., Meeker, A. K. Dual-label centromere and telomere FISH identifies human, rat, and mouse cell contribution to Multispecies recombinant urogenital sinus xenografts. Prostate. , (2009).
- Vander Griend, D. J., Konishi, Y., De Marzo, A. M., Isaacs, J. T., Meeker, A. K. Dual-label centromere and telomere FISH identifies human, rat, and mouse cell contribution to Multispecies recombinant urogenital sinus xenografts. Prostate. 69, 1557-1564 (2009).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 637-646 (2006).
- Prokhorova, T. A., et al. Teratoma formation by human embryonic stem cells is site dependent and enhanced by the presence of Matrigel. Stem Cells Dev. 18, 47-54 (2009).
- Hameed, O., Sublett, J., Humphrey, P. A. Immunohistochemical stains for p63 and alpha-methylacyl-CoA racemase, versus a cocktail comprising both, in the diagnosis of prostatic carcinoma: a comparison of the immunohistochemical staining of 430 foci in radical prostatectomy and needle biopsy tissues. Am. J. Surg. Pathol. 29, 579-587 (2005).
- Wang, Y. A human prostatic epithelial model of hormonal carcinogenesis. Cancer Res. 61, 6064-6072 (2001).
- Yao, V., Parwani, A., Maier, C., Heston, W. D., Bacich, D. J. Moderate expression of prostate-specific membrane antigen, a tissue differentiation antigen and folate hydrolase, facilitates prostate carcinogenesis. Cancer Res. 68, 9070-9077 (2008).
- Cunha, G. R., Cooke, P. S., Kurita, T. Role of stromal-epithelial interactions in hormonal responses. Arch. Histol. Cytol. 67, 417-434 (2004).
- Xin, L., Ide, H., Kim, Y., Dubey, P., Witte, O. N. In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11896-11903 (2003).
- Yu, X. Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells. Mol. Ther. 7, 827-838 (2003).
- Anderson, J. S., Bandi, S., Kaufman, D. S., Akkina, R. Derivation of normal macrophages from human embryonic stem (hES) cells for applications in HIV gene therapy. Retrovirology. 3, 24 (2006).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3, 340-345 (2008).
