인간의 피부 생검에서 통각 Intraepidermal 신경 섬유의 3 차원 영상
Summary
고통스러운 신경 병증 (PN)의 통각 intraepidermal 신경 섬유 (IENFs)의 변화를 연구하기 위해, 우리는 직접 통각 IENFs에서 관찰 입체 형태 변화를 검사 할 수 프로토콜을 개발했다. IENFs의 3 차원 분석은 PN에 IENF의 형태 학적 변화를 평가하는 잠재력을 가지고있다.
Abstract
피부 펀치 생검은 일반적으로 말초 신경 병증 1,2의 진단 intraepidermal 신경 섬유 밀도 (IENFD)을 정량화하는 데 사용됩니다. 현재, 그것은 말초 다리 (DL) 및 길이에 따라 polyneuropathies 3의 평가를위한 근위 허벅지 (PT)에서 3mm 피부 생검을 수집하는 것이 일반적 관행이다. 그러나 IENFs의 다각적 인 특성으로 인해, 2 차원 (2D) 영상의 분석을 통해 신경 구조를 중복 검사하는 도전이다. 또한, 입체 (3D) 영상이 딜레마에 대한 더 나은 솔루션을 제공 할 수 있습니다.
현재 보고서에서, 우리는 고통스러운 신경 병증 (PN)을 연구하는 3D 이미지를 적용하는 방법을 제시한다. IENFs를 확인하기 위해 피부 샘플은 단백질 유전자 제품 9.5 (PGP), 팬 신경 세포 마커의 면역 형광 분석을 위해 처리됩니다. 현재, 그것은 IENFD을 억제하여 작은 섬유 신경 병증을 진단하는 표준 방법입니다브라이트 현미경 4를 사용하여 PGP의 면역 조직 화학 염색에 의해 채굴. 현재의 연구에서는, 우리는 PGP를 사용하여 총 IENFD를 식별하기 위해 이중 면역 형광 분석을 적용하고, 통각 IENF, 신경 성장 인자 5 (TRK), 높은 친화력 수용체 트로포 마이 오신 수용체 키나제 인식 항체의 사용을 통해. PGP와 TRK 항체 공동 염색 IENF의 장점은 명확 PGP 양성, 통각 섬유를 염색 PN의 연구를 혜택을 제공합니다. 이 형광 신호는 PN과 관련된 IENF의 통각 IENFD 형태 학적 변화를 확인하기 위해 정량화 할 수있다. 형광 이미지는 공 촛점 현미경에 의해 인수 및 3D 분석을 위해 처리됩니다. 3 차원 영상은 더 PN과 관련된 형태 학적 변화를 분석하는 회전 능력을 제공합니다. 함께 촬영, 형광 공동 염색, 공 촛점 이미징 및 3D 분석은 명확 PN의 연구를 혜택을 누릴 수 있습니다.
Introduction
현재, 작은 섬유 신경 병증 3, 6-8를 진단하는 데 사용할 수있는 피부 펀치 생검에서 intraepidermal 신경 섬유 밀도 (IENFD)을 정량화하는 의사에 대한 일반적인 방법입니다. 생검은 말초 다리 (DL), 외측 복사뼈 위 10cm, 그리고 근위부 허벅지 (PT), 전방 장골 척추 9 아래 20cm에서 가져옵니다. 모든 IENF는 단백질 유전자 제품 9.5 (PGP), 팬의 연결 마커 10-12을 사용하여 레이블이 표시됩니다. 현재, 그것은 표준 사용하여 작은 섬유 신경 병증을 진단하는 방법 브라이트 현미경 6 PGP 염색에 의해 결정 IENFD.입니다 또한 여러 연구 그룹은 PGP 면역 7-9에 대한 면역 형광 프로토콜을 사용했습니다. 작은 섬유 신경 병증은 일반적으로 신경 병증 성 통증과 연관됩니다. 또한 통증 처리를위한 필수 IENF의 역할을 이해하기 위해, 우리는 고통을 생성 섬유와 공동 레이블을 총 IENF하는 기술을 개발했다. Nocicep특히 Aδ TIVE IENF 및 C 섬유는, PGP와 IENF의 공동 레이블과 통각 마커, 트로포 마이 오신 수용체 키나제 A (TRK) 5를 통해 공부하실 수 있습니다. TRK A는 통각의 발전을 위해 필수적인 신경 성장 인자에 대한 높은 친화력 수용체이다. TRK 긍정적 인 통각 신경 섬유는 peptidergic 섬유 것을 표현 물질 P (SP) 및 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드 (CGRP). 이전 로리아와 동료 PN, 10 통각 마커와 협력 라벨 PGP 양성 IENF를 연구하는 두 배 레테르를 붙이는 기술을 적용했다. 우리의 이전 연구에서, 우리는 TRK 양성 IENF하지만 TRK-음 IENF는 고통스러운 당뇨병 성 신경 병증 5의 동물 모델에서 발현이되었다는 것을 보여 주었다. 이 공동 라벨링 기술은 IENFD 및 PN과 관련된 형태 학적 변화를 연구 할 수있는 능력을 합계하는 통각 IENFD의 정량을 비교하는 기능을 제공합니다. 통각 IENF 및 안돼요을 시각화 할 수있는 능력통각 IENFD에 총 IENFD의 재 정량화 PN과 관련된 통증의 정도에 목표 고통의 존재에 대한 증거, 그리고 아마도 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 기술은 또한 동물 모델의 피부에 적용됩니다. 이전의 연구에 비해, 현재의 프로토콜은 2D 이미지 분석에서 발생할 수있는 오류를 방지 할 수있는 기회를 만들고, 3D 이미지 분석을위한 방법을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
IENFD의 측정은 널리 말초 신경 병증 13,14의 정도를 결정하는 데 사용되었다. 현재 가장 일반적으로 사용되는 프로토콜은 표피의 기저막을 통과 신경 섬유의 밀도를 측정, 그것은 고려 축삭 분기 및 / 또는 신경의 형태 학적 변화를 고려하지 않습니다. 또한, 현재 IENFD 분석 PN 15 고통의 존재와 IENFD 상관 관계를 보여되지 않았습니다.
우리는 이전에 통각 IENFD의 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 건강 보조금 국립 연구소에 의해 지원되었다 K08 NS061039-01A2, 신경 연구 및 발견, 미시간 대학의 A. 알프레드 터 브먼 의학 연구소의 프로그램입니다. 이 작품은 형태와 당뇨병과 소화기 및 신장 질환의 국립 연구소의 건강 그랜트 5P90 DK-20572 국립 연구소에 의해 자금 미시간 당뇨병 연구 및 교육 센터의 이미지 분석 코어를 사용했습니다. 저자는 통각 바이오 마커 면역 기술의 초기 개발을 지원하기 위해 인간의 피부 샘플을 자신의 관대 한 기부에 대한 로빈슨 싱글과 고든 스미스 (유타 대학) 감사드립니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | To make up 1X PBS |
| Image-IT FX Signal | Invitrogen | I36933 | Image-IT |
| Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit) | AbD Serotec | 7863-0504 | PGP |
| Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat) | R&D Systems | AF1056 | Trk A |
| Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit | Invitrogen | A21206 | AF488 donkey α-goat |
| Alexa Fluor 647 donkey α-goat | Invitrogen | A21447 | AF647 donkey α-goat |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich | A7906-100 | BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich | T9284 | TX-100 |
| Non-calibrated Loop | LeLoop | MP 199025 | inoculating Loop |
| 96-well assay plate | Corning Incorporated | 3603 | Well plate |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | DAPI |
| Microscope Cover Glass 22×22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | Coverslips |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Microscope Slides |
| Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV500 | Confocal Microscope |
| Optimum Cutting Temperature | Sakura | 4583 | OCT |
| Leica cryostat | Leica | CM1850 | Cryostat |
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