التصوير ثلاثي الأبعاد من مسبب الألياف العصبية داخل البشرة في خزعات الجلد البشري
Summary
من أجل دراسة التغيرات من الألياف العصبية داخل البشرة مسبب (IENFs) في اعتلال الأعصاب المؤلم (PN)، قمنا بتطوير البروتوكولات التي يمكن أن تفحص مباشرة التغيرات المورفولوجية ثلاثي الأبعاد لوحظ في IENFs مسبب. تحليل ثلاثي الأبعاد للIENFs لديه القدرة على تقييم التغيرات المورفولوجية للIENF في PN.
Abstract
A لكمة خزعة من الجلد يستخدم عادة لقياس كثافة الألياف العصبية داخل البشرة (IENFD) لتشخيص اعتلال الأعصاب الطرفية من 1،2. في الوقت الحاضر، بل هو ممارسة شائعة لجمع 3 خزعات الجلد مم من الساق البعيدة (DL) والفخذ الدانية (PT) لتقييم polyneuropathies التي تعتمد على طول 3. ومع ذلك، نظرا لطبيعة متعددة الاتجاهات من IENFs، فإنه يمثل تحديا لدراسة تداخل الهياكل العصبية من خلال تحليل ثنائي الأبعاد (2D) التصوير. بدلا من ذلك، يمكن ثلاثي الأبعاد (3D) التصوير توفر حلا أفضل لهذه المعضلة.
في التقرير الحالي، فإننا نقدم طرق لتطبيق التصوير 3D لدراسة الاعتلال العصبي المؤلم (PN). من أجل تحديد IENFs، تتم معالجة عينات الجلد لتحليل مناعي للبروتين منتج الجين 9.5 (PGP)، علامة العصبية عموم. في الوقت الحاضر، فمن الممارسة القياسية لتشخيص اعتلال الأعصاب الألياف الصغيرة باستخدام IENFD ردعتستخرجه PGP المناعية باستخدام المجهري brightfield 4. وفي الدراسة الحالية، طبقنا تحليل مناعي مزدوج لتحديد مجموع IENFD، وذلك باستخدام PGP، وIENF مسبب، من خلال استخدام الأجسام المضادة التي تعترف تروبوميوزين مستقبلات كيناز A (تورك A)، ومستقبلات تقارب السامي لعامل نمو العصب 5. مزايا IENF شارك في تلطيخ مع PGP وتورك A الأجسام المضادة تفيد دراسة PN بواسطة تلطيخ بوضوح إيجابية PGP، والألياف مسبب. يمكن قياس هذه الإشارات الفلورسنت لتحديد التغيرات المورفولوجية IENFD ومسبب من IENF المرتبطة PN. يتم الحصول على الصور الفلورسنت بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر وتجهيزها للتحليل 3D. يوفر 3D التصوير قدرات التناوب إلى مزيد من تحليل التغيرات المورفولوجية المرتبطة PN. أخذت معا، فلوري شارك في تلطيخ، والتصوير متحد البؤر، وتحليل 3D تستفيد بوضوح دراسة PN.
Introduction
في الوقت الحاضر، بل هو ممارسة شائعة للأطباء لقياس كثافة الألياف العصبية داخل البشرة، (IENFD) من الجلد الخزعات لكمة، والتي يمكن استخدامها لتشخيص اعتلال الأعصاب الألياف الصغيرة 3، 6-8. يتم أخذ خزعات من الساق البعيدة (DL)، و 10 سم فوق الكعب الوحشي، والفخذ الدانية (PT)، و 20 سم تحت العمود الفقري الحرقفي الأمامي 9. وصفت جميع IENF باستخدام بروتين منتج الجين 9.5 (PGP)، علامة العصبية عموم 10-12. في الوقت الحاضر، فمن الممارسة القياسية لتشخيص اعتلال الأعصاب الألياف الصغيرة باستخدام IENFD يحدده تلطيخ PGP مع المجهري brightfield 6. بالإضافة إلى ذلك، قد استخدمت العديد من المجموعات البحثية بروتوكولات مناعي لPGP المناعية 7-9. ويرتبط الاعتلال العصبي الألياف الصغيرة عادة مع ألم الأعصاب. من أجل زيادة فهم دور IENF ضرورية لمعالجة الألم، قمنا بتطوير تقنية للمشاركة في تسمية مجموع IENF مع الألياف التي تولد الألم. NocicepTIVE IENF، Aδ على وجه التحديد والألياف C، يمكن دراستها من خلال المشاركة في وضع العلامات من IENF مع PGP وعلامة مسبب، تروبوميوزين مستقبلات كيناز A (تورك A) 5. TRK A هو مستقبلات تقارب السامي لعامل نمو الأعصاب التي لا غنى عنها لتنمية حس الألم. وتورك A-إيجابي الألياف العصبية مسبب هي ألياف ببتيدي المفعول التي تعبر عن جوهر P (SP) والكالسيتونين الجينات ذات الصلة الببتيد (CGRP). سابقا، لوريا وزملاؤه تطبيق تقنية مزدوجة وضع العلامات لدراسة PN، وشارك في وضع العلامات IENF إيجابية PGP مع علامة مسبب 10. في دراستنا السابقة، أثبتنا أن تورك IENF A-إيجابي، ولكن ليس تورك IENF A-السلبية، وupregulated في نموذج حيواني من الاعتلال العصبي السكري مؤلمة 5. توفر هذه التقنية شارك في وضع العلامات القدرة على مقارنة الكمي للIENFD مسبب إلى إجمالي IENFD والقدرة على دراسة التغيرات المورفولوجية المرتبطة PN. القدرة على تصور IENF مسبب والمقارنةالكمي إعادة IENFD الإجمالي إلى IENFD مسبب يمكن أن توفر دليل موضوعي على وجود الألم، وربما نظرة ثاقبة من شدة الألم الذي يصاحب PN. هذه التقنية قابلة للتطبيق على الجلد من النماذج الحيوانية أيضا. بالمقارنة مع الدراسات السابقة، ويصف البروتوكول الحالي طرق لتحليل الصور 3D، وخلق فرصة لتجنب الأخطاء التي يمكن أن تحدث في تحليل الصور 2D.
Protocol
Representative Results
Discussion
قياس IENFD وقد استخدم على نطاق واسع لتحديد درجة من اعتلال الأعصاب المحيطية 13،14. في الوقت الحاضر، والبروتوكول الأكثر استخداما يقيس فقط كثافة من الألياف العصبية التي تخترق الغشاء القاعدي في البشرة، وهي لا تأخذ بعين الاعتبار المحاور المتفرعة و / أو التغيرات المورفو…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح K08-01A2 NS061039، وبرنامج الأمراض العصبية بحوث واكتشاف، وألف توبمان معهد ألفريد بحوث الطبية في جامعة ميشيغان. يستخدم هذا العمل مورفولوجية وصورة التحليل الأساسي للميشيغان أبحاث السكري ومركز التدريب، بتمويل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح 5P90 DK-20572 من المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى. فإن الكتاب أود أن أشكر روبنسون سينغلتون وغوردون سميث (جامعة يوتا) للتبرع السخي من عينات الجلد البشري لدعم التطوير الأولي للمسبب العلامات البيولوجية تقنية المناعية.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | To make up 1X PBS |
| Image-IT FX Signal | Invitrogen | I36933 | Image-IT |
| Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit) | AbD Serotec | 7863-0504 | PGP |
| Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat) | R&D Systems | AF1056 | Trk A |
| Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit | Invitrogen | A21206 | AF488 donkey α-goat |
| Alexa Fluor 647 donkey α-goat | Invitrogen | A21447 | AF647 donkey α-goat |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich | A7906-100 | BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich | T9284 | TX-100 |
| Non-calibrated Loop | LeLoop | MP 199025 | inoculating Loop |
| 96-well assay plate | Corning Incorporated | 3603 | Well plate |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | DAPI |
| Microscope Cover Glass 22×22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | Coverslips |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Microscope Slides |
| Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV500 | Confocal Microscope |
| Optimum Cutting Temperature | Sakura | 4583 | OCT |
| Leica cryostat | Leica | CM1850 | Cryostat |
References
- Lauria, G., Holland, N., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
- Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. Mouse models of diabetic neuropathy. Neurobiol. Dis. 28 (3), 276-285 (2007).
- McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency. Arch. Neurol. 55 (12), 1513-1520 (1998).
- Griffin, J. W., McArthur, J. C., Polydefkis, M. Assessment of cutaneous innervation by skin biopsies. Curr. Opin. Neurol. 14 (5), 655-659 (2001).
- Cheng, H. T., Dauch, J. R., Hayes, J. M., Yanik, B. M., Feldman, E. L. Nerve growth factor/p38 signaling increases intraepidermal nerve fiber densities in painful neuropathy of type 2 diabetes. Neurobiol. Dis. 45 (1), 280-287 (2012).
- Lauria, G., Lombardi, R., Camozzi, F., Devigili, G. Skin biopsy for the diagnosis of peripheral neuropathy. Histopathology. 54 (3), 273-285 (2009).
- Vlckova-Moravcova, E., Bednarik, J., Dusek, L., Toyka, K. V., Sommer, C. Diagnostic validity of epidermal nerve fiber densities in painful sensory neuropathies. Muscle Nerve. 37 (1), 50-60 (2008).
- Casanova-Molla, J., Morales, M., et al. Axonal fluorescence quantitation provides a new approach to assess cutaneous innervation. J. Neurosci. Methods. 200 (2), 190-198 (2011).
- Wang, L., Hilliges, M., Jernberg, T., Wiegleb-Edstrom, D., Johansson, O. Protein gene product 9.5-immunoreactive nerve fibres and cells in human skin. Cell Tissue Res. 261 (1), 25-33 (1990).
- Lauria, G., Morbin, M., et al. Expression of capsaicin receptor immunoreactivity in human peripheral nervous system and in painful neuropathies. J. Peripher. Nerv. Syst. 11 (3), 262-271 (2006).
- Penna, G., Fibbi, B., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J. Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
- Lentz, S. I., Edwards, J. L., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J. Histochem. Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
- Polydefkis, M., Hauer, P., Griffin, J. W., McArthur, J. C. Skin biopsy as a tool to assess distal small fiber innervation in diabetic neuropathy. Diabetes Technol. Ther. 3 (1), 23-28 (2001).
- Lauria, G. Small fibre neuropathies. Curr. Opin. Neurol. 18 (5), 591-597 (2005).
- Sorensen, L., Molyneaux, L., Yue, D. K. The relationship among pain, sensory loss, and small nerve fibers in diabetes. Diabetes Care. 29 (4), 883-887 (2006).
- Lauria, G., Morbin, M., et al. Axonal swellings predict the degeneration of epidermal nerve fibers in painful neuropathies. Neurology. 61 (5), 631-636 (2003).
- Herrmann, D. N., McDermott, M. P., et al. Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy. Muscle Nerve. 29 (3), 420-427 (2004).
- Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).
